膠體金免疫層析法快速檢測C反應蛋白的研究.pdf

1、背景:
　　C反應蛋白(C reactiveprotein, CRP)自從在急性感染者血液中被發(fā)現(xiàn)后，因能夠反應感染性疾病的動態(tài)變化，已被臨床上廣泛應用于炎癥的輔助診斷[1]，相關的檢測方法、產品不斷涌現(xiàn)，但目前獲批的CRP定量檢測相關產品均需要借助設備來完成，不適合現(xiàn)場、社區(qū)醫(yī)院、鄉(xiāng)村等基層醫(yī)療機構使用。因此，研究開發(fā)不需要借助任何設備即可快速檢測CRP含量的膠體金免疫層析試紙條具有重要的臨床價值和社會意義。
　　目的:<

2、br>　　建立基于自制比色卡半定量檢測CRP含量的雙抗體夾心膠體金免疫層析法
　　方法:
　　1.CRP比色卡定值點的確定:根據(jù)臨床診斷標準，確定比色卡三個定值點。
　　2.CRP室內質控品的制備:利用CRP低值血清作為基質血清稀釋CRP高值血清，另外添加類風濕因子、三酰甘油等干擾物質制備一系列室內質控品，并采用羅氏試劑進行復核。
　　3.CRP試紙條的制備及工藝優(yōu)化:采用檸檬酸三鈉還原法制備不同粒徑的膠體金，采

3、用功能性實驗確定膠體金最優(yōu)粒徑、最佳pH和蛋白標記量、最佳蛋白包被量;采用正交實驗確定樣品墊處理液的成分及含量;通過全血、血漿、血清的稀釋倍數(shù)研究確定不同標本的稀釋倍數(shù)，制備比色卡，并在實驗基礎上將反應體積放大100倍，驗證工藝的穩(wěn)定性。
　　4.試紙條性能評價:選用室內質控品對試紙條的靈敏度、精密性、批間差、特異性、鉤狀(HOOK)效應、穩(wěn)定性、檢測環(huán)境條件等進行研究。
　　5.實驗室臨床標本檢測:從中心標本庫選200份臨

4、床標本進行檢測并與對照試劑對照，確認一致性。
　　結果:
　　1.確定CRP比色卡三個定值點由淺到深分別為10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。
　　2.配制CRP室內質控品14份:含類風濕因子(150 IU/mL)、三酰甘油(16mmol/L)和不含干擾因素的CRP終濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL樣本共12份，HOOK效應樣本(CRP1046μg/mL)及低值樣本

5、（CRP0.57μg/mL）各1份。
　　3.初步建立了比色法檢測CRP的試紙條制備方法，選用1.6的膠體金加入0.05％疊氮鈉存放，每毫升膠體金加入0.02 M K2CO320μL、標記抗體6μg。包被抗體1.2mg/mL。組條后對樣本稀釋倍數(shù)研究發(fā)現(xiàn)血清、血漿稀釋200倍、全血稀釋120倍后加樣75μL檢測結果一致。試紙條制備工藝放大實驗用室內質控品檢測合格。
　　4.試紙條性能檢測顯示:CRP濃度為5μg/mL時檢測線

6、不顯色，10μg/mL時顯色。采用P1、P2、P3連續(xù)3次，顯色無差別，且與比色卡相應條帶顯色一致。類風濕因子(150 IU/mL)、三酰甘油（16 mmol/L）對結果無干擾，CRP濃度1046μg/mL時無HOOK效應。
　　5.檢測200份臨床標本并與萬孚產品對照，全血、血清、血漿的符合率分別為:50μg/mL以下為100％;50μg/mL-100μg/mL之間為93.8％、99％、95.6％;100μg/mL以上為92.6