膠體金免疫層析法快速檢測C反應(yīng)蛋白的研究.pdf

1、背景:
　　C反應(yīng)蛋白(C reactiveprotein, CRP)自從在急性感染者血液中被發(fā)現(xiàn)后，因能夠反應(yīng)感染性疾病的動態(tài)變化，已被臨床上廣泛應(yīng)用于炎癥的輔助診斷[1]，相關(guān)的檢測方法、產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，但目前獲批的CRP定量檢測相關(guān)產(chǎn)品均需要借助設(shè)備來完成，不適合現(xiàn)場、社區(qū)醫(yī)院、鄉(xiāng)村等基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。因此，研究開發(fā)不需要借助任何設(shè)備即可快速檢測CRP含量的膠體金免疫層析試紙條具有重要的臨床價(jià)值和社會意義。
　　目的:<

2、br>　　建立基于自制比色卡半定量檢測CRP含量的雙抗體夾心膠體金免疫層析法
　　方法:
　　1.CRP比色卡定值點(diǎn)的確定:根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，確定比色卡三個(gè)定值點(diǎn)。
　　2.CRP室內(nèi)質(zhì)控品的制備:利用CRP低值血清作為基質(zhì)血清稀釋CRP高值血清，另外添加類風(fēng)濕因子、三酰甘油等干擾物質(zhì)制備一系列室內(nèi)質(zhì)控品，并采用羅氏試劑進(jìn)行復(fù)核。
　　3.CRP試紙條的制備及工藝優(yōu)化:采用檸檬酸三鈉還原法制備不同粒徑的膠體金，采

3、用功能性實(shí)驗(yàn)確定膠體金最優(yōu)粒徑、最佳pH和蛋白標(biāo)記量、最佳蛋白包被量;采用正交實(shí)驗(yàn)確定樣品墊處理液的成分及含量;通過全血、血漿、血清的稀釋倍數(shù)研究確定不同標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，制備比色卡，并在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上將反應(yīng)體積放大100倍，驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定性。
　　4.試紙條性能評價(jià):選用室內(nèi)質(zhì)控品對試紙條的靈敏度、精密性、批間差、特異性、鉤狀(HOOK)效應(yīng)、穩(wěn)定性、檢測環(huán)境條件等進(jìn)行研究。
　　5.實(shí)驗(yàn)室臨床標(biāo)本檢測:從中心標(biāo)本庫選200份臨

4、床標(biāo)本進(jìn)行檢測并與對照試劑對照，確認(rèn)一致性。
　　結(jié)果:
　　1.確定CRP比色卡三個(gè)定值點(diǎn)由淺到深分別為10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。
　　2.配制CRP室內(nèi)質(zhì)控品14份:含類風(fēng)濕因子(150 IU/mL)、三酰甘油(16mmol/L)和不含干擾因素的CRP終濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL樣本共12份，HOOK效應(yīng)樣本(CRP1046μg/mL)及低值樣本

5、（CRP0.57μg/mL）各1份。
　　3.初步建立了比色法檢測CRP的試紙條制備方法，選用1.6的膠體金加入0.05％疊氮鈉存放，每毫升膠體金加入0.02 M K2CO320μL、標(biāo)記抗體6μg。包被抗體1.2mg/mL。組條后對樣本稀釋倍數(shù)研究發(fā)現(xiàn)血清、血漿稀釋200倍、全血稀釋120倍后加樣75μL檢測結(jié)果一致。試紙條制備工藝放大實(shí)驗(yàn)用室內(nèi)質(zhì)控品檢測合格。
　　4.試紙條性能檢測顯示:CRP濃度為5μg/mL時(shí)檢測線

6、不顯色，10μg/mL時(shí)顯色。采用P1、P2、P3連續(xù)3次，顯色無差別，且與比色卡相應(yīng)條帶顯色一致。類風(fēng)濕因子(150 IU/mL)、三酰甘油（16 mmol/L）對結(jié)果無干擾，CRP濃度1046μg/mL時(shí)無HOOK效應(yīng)。
　　5.檢測200份臨床標(biāo)本并與萬孚產(chǎn)品對照，全血、血清、血漿的符合率分別為:50μg/mL以下為100％;50μg/mL-100μg/mL之間為93.8％、99％、95.6％;100μg/mL以上為92.6