膠體金免疫層析法及其在氯霉素快速檢測(cè)中的初步研究.pdf

1、膠體金免疫層析試紙條（Colloidal Gold Immunochromatographic Strips）檢測(cè)法是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)對(duì)微量抗原或抗體進(jìn)行測(cè)定的方法。本文以食品中禁用的抗生素----氯霉素（CAP）為檢測(cè)對(duì)象，主要開(kāi)展了以下工作：
　　 (1)采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金（Colloidal Gold），根據(jù)檸檬酸三鈉加入量的不同，考察加熱不同時(shí)間對(duì)膠體金制備的影響，并通過(guò)分光光度法、激光粒度儀法

2、，透射電鏡法對(duì)合成的膠體金進(jìn)行質(zhì)量鑒定。并以粒徑大小作為考察因素，對(duì)分光光度法、激光粒度儀法、透射電鏡法進(jìn)行比較。
　　 (2)采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)了氯霉素單克隆抗體，并通過(guò)蛋白G親和層析柱對(duì)單抗進(jìn)行純化，然后通過(guò)蛋白經(jīng)驗(yàn)公式OD280/1.35對(duì)單抗含量進(jìn)行初步測(cè)定，接著通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)單抗效價(jià)進(jìn)行測(cè)定以及活性進(jìn)行鑒定，最后建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定CAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 (3)采用分光光度法確定膠體

3、金和氯霉素單抗偶聯(lián)的最適pH 值以及單抗的最小加入量，并通過(guò)高速離心法對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行純化，接著通過(guò)分光光度法，激光粒度儀法，透射電鏡法對(duì)偶聯(lián)物的粒徑大小，分布情況進(jìn)行表征，最后通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和試紙條法對(duì)偶聯(lián)物活性進(jìn)行鑒定。
　　 (4)采用EDC法將琥珀氯霉素和BSA 進(jìn)行偶聯(lián)，通過(guò)分光光度法進(jìn)行偶聯(lián)率的測(cè)定，并通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)偶聯(lián)物的活性進(jìn)行鑒定。
　　 (5)對(duì)試紙條所用溶液以及試紙條耗材進(jìn)行篩選和

4、處理，將各部件組裝成試紙條，對(duì)陰性樣品和陽(yáng)性樣品（10ng/mL CAP）進(jìn)行檢測(cè)。
　　 通過(guò)以上研究獲得以下結(jié)果：
　　 (1)檸檬酸三鈉加入量1.0mL時(shí)，最優(yōu)加熱時(shí)間為15min；檸檬酸三鈉加入量1.5mL時(shí)，最優(yōu)加熱時(shí)間為12min；檸檬酸三鈉加入量為4.0mL時(shí)，最優(yōu)加熱時(shí)間為9min。
　　 (2)通過(guò)體內(nèi)誘生腹水法共生產(chǎn)氯霉素單抗約6.147mg，根據(jù)蛋白含量的高低，把單抗分裝成兩管，低濃度管單抗

5、效價(jià)1：3000，IC50為0.368ppb，檢出限為0.047ppb；高濃度單抗效價(jià)1：50000，IC50為0.426ppb，檢出限為0.055ppb。
　　 (3)膠體金和氯霉素單抗偶聯(lián)的最適pH 值為8.0，200uL 膠體金對(duì)應(yīng)的最小蛋白含量為1.92ug。偶聯(lián)物粒徑比膠體金大，并具有生物活性。
　　 (4)CBSA/CCAP=34.4，即每個(gè)BSA分子上連接了34.4個(gè)氯霉素分子，偶聯(lián)物具有活性，包被抗原用于