利用膠體金免疫層析技術快速檢測柑橘潰瘍病菌.pdf

1、柑橘潰瘍病(CitrusBacterialCanker，CBC)是由地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種(Xanthomonasaxonopodispv.citri,Xac)引起的一種影響全球柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的國內(nèi)外重大檢疫性病害。其主要通過帶菌種苗、接穗、果實等柑橘材料的調(diào)運進行遠距離傳播，田間病害主要靠病菌隨風夾雨擴散，病菌在自然狀態(tài)下的存活期較長。對于該病的檢疫檢驗，除傳統(tǒng)的方法外，近年來國外已發(fā)展了PCR等分子檢驗技術，但并不能滿足口岸及基

2、層植保站對柑橘潰瘍病的快速篩查。我國加入WTO以后，柑橘潰瘍病檢疫的新形勢迫切要求建立一種快速、靈敏、準確的適合口岸及基層檢驗檢疫部門的檢驗技術體系。 本研究的目的是通過家兔免疫獲得柑橘潰瘍病多克隆抗體，用于標記納米級的膠體金顆粒和包被硝酸纖維素膜(Nitrocellulosemembrane)，并結合層析技術制備檢測柑橘潰瘍病菌的膠體金免疫層析(Colloidalgoldimmunochromatographicassay，C

3、IA)測試卡，最終建立起快速準確而又穩(wěn)定安全的柑橘潰瘍病菌膠體金免疫層析快速檢測技術體系，其可用于大量柑橘樣品的快速檢驗，為柑橘非疫生產(chǎn)區(qū)建設和病害預警監(jiān)測提供一種快速檢測技術和實用工具。 研究首先利用柑橘潰瘍病全胞菌免疫家兔獲得高免血清，提純出柑橘潰瘍病菌多克隆抗體；而后用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備30nm的膠體金顆粒，將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.0，加入柑橘潰瘍病菌多克隆抗體20μg/ml，用磁力攪拌器連續(xù)攪拌1h，制備出

4、金標抗體；再通過高速離心純化金標抗體；結合免疫層析技術制成測試卡；通過對濃度101-108cfu/ml柑橘潰瘍病菌菌懸液的檢測，測出測試卡的靈敏度；通過對不同細菌及柑橘表面的腐生菌的檢測，測出測試卡的特異性；通過在不同條件保存的膠體金及測試卡檢測，得出膠體金及測試卡的保存期及最佳保存方法。 研究結果表明，1)特異性測試結果顯示，水稻白葉枯菌，水稻細菌性條斑病菌，枯草芽孢桿菌，大腸桿菌以及柑橘葉片表面腐生菌Xaco02、Xaco0

5、1、Xaco03、Xaco05、Xaco06、Xaco07、Xaco08的結果均為陰性，由此得出本實驗研制的膠體金免疫層析測試卡的特異性較好。2)靈敏度測試結果顯示，本實驗研制的膠體金免疫層析測試卡的靈敏度為106cfu/ml。3)在制備好的膠體金溶液中加入50﹪的甘油，于-20℃保存，膠體金可以保存70天；膠體金溶液于4℃保存，可以保存20天。制備好的免疫膠體金測試卡在不同的保存條件下保存期有很大差異，在4℃冰箱中可以保存14天；在4