ELISA法和膠體金免疫層析法檢測豬尿樣中的萊克多巴胺.pdf

1、萊克多巴胺是一種β<,2>-興奮劑，能夠加強心臟收縮、擴張骨骼肌血管和支氣管平滑肌，在獸醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)上可用于治療休克和支氣管痙攣。萊克多巴胺還具有加強體內(nèi)代謝的作用，可以促進脂肪分解和蛋白質(zhì)合成。但當人體累計攝入量超過一定值，或食入萊克多巴胺高殘留量的食物時，會產(chǎn)生毒副作用。因此，歐洲以及中國都禁止萊克多巴胺用于家畜飼養(yǎng)中，在中國非法使用萊克多巴胺的報道卻不斷出現(xiàn)，它是繼瘦肉精后廣泛被用于家畜飼養(yǎng)的β<,2>-興奮劑。目前萊克多巴胺的檢測

2、遠遠不能滿足快速，廉價，穩(wěn)定和準確等方面的要求。本研究旨在建立兩種免疫分析方法用于樣本中萊克多巴胺的快速篩選。 本研究內(nèi)容主要包括以下三個部分： 1) 萊克多巴胺人工抗原的制備 本研究先將萊克多巴胺與琥珀酸酐在吡啶溶液中反應(yīng)，連接上羧基后，采用改良的 EDC法——EDC-NHS法，并使用陽離子化的牛血清白蛋白作為免疫抗原偶聯(lián)載體，卵清蛋白作為包被抗原偶聯(lián)載體。研究結(jié)果表明，萊克多巴胺琥珀酸酐活化率達到85％，萊克

3、多巴胺琥珀酸酐:EDC:NHS摩爾比為 1:2:5，活化時間為 15 min，偶聯(lián)時間為2 h，萊克多巴胺琥珀酸酐：蛋白質(zhì)起始摩爾比20:1。最后免疫抗原萊克多巴胺與陽離子化牛血清白蛋白 (Bovine serumalbumin，簡稱為 BSA)的偶聯(lián)物，偶聯(lián)比達到 14.3，偶聯(lián)效率達到 71.5％：包被抗原萊克多巴胺與卵清蛋白(Ovumalbumin，簡稱為 OVA)，偶聯(lián)比為 7.5，偶聯(lián)效率達到 37.5％。 2) 萊克

4、多巴胺間接競爭ELISA法的建立 用以上制備的萊克多巴胺與陽離子化牛血清白蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原，制備抗萊克多巴胺的單克隆抗體，將獲得的抗萊克多巴胺單克隆分離純化后，用于建立 ELISA 檢測方法。建立了萊克多巴胺間接競爭 ELJSA 檢測方法，各生產(chǎn)工藝參數(shù)如下：包被抗原 0.6 μg/mL，1.18 mg/mL 抗體稀釋 8000 倍，1mg/mL 酶標二抗(山羊抗小鼠)稀釋 5000 倍。制備的 ELISA 法檢測靈敏度為

5、 0.1 ng/mLIC<,50>為 2 ng/mL，檢測范圍為 0.1～1000 ng/mL，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林等四種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于 0.2‰。用該 ELISA 法對經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用法驗證為萊克多巴胺陰性豬尿樣本進行加標回收實驗，回收率為 70％～106.2％。 3) 萊克多巴胺膠體金免疫層析法的建立 將得到的抗萊克多巴胺單克隆抗體用于制備金標抗體，制備的人工抗原萊克多巴胺一卵清蛋白用

6、于包被 NC 膜。萊克多巴胺膠體金免疫層析試紙條的生產(chǎn)工藝參數(shù)如下：膠體金顆粒大小為40nm，標記抗體量為10μg/mL，噴金OD值為5，抗原濃度為 0.5 mg/mL。參照以上條件組裝的萊克多巴胺膠體金免疫層析試紙條檢測靈敏度達到5ng/mL，檢測范圍為0～10000 ng/mL，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林等四種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于 5‰。對100份樣本進行檢測，假陰性率為0，假陽性率為3.2％。60℃加速保