ATF3通過AP-1調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌.pdf

1、背景:眾所周知，粘液的過表達(dá)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)的重要病理特征。研究表明，香煙煙霧(cigarette smoke，CS)暴露與COPD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。氣道粘液的過度分泌可引起氣道阻塞，從而導(dǎo)致肺功能下降。轉(zhuǎn)錄激活因子3(Activating transcription factor3，ATF3)是一種參與細(xì)胞反應(yīng)過程的適應(yīng)性反應(yīng)基因。研究顯示其對(duì)炎

2、癥反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)不同的靶基因從而加強(qiáng)或抑制炎癥反應(yīng)，機(jī)體會(huì)根據(jù)應(yīng)激條件的性質(zhì)（如應(yīng)激的類型和持續(xù)的時(shí)間）和應(yīng)激信號(hào)影響靶組織/細(xì)胞類型的不同而發(fā)生不同的反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，氣道粘液的過表達(dá)也是氣道炎癥反應(yīng)的一種表現(xiàn)形式。然而，迄今為止國內(nèi)外尚未有研究探討氣道上皮細(xì)胞中ATF3的表達(dá)在調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液分泌中的作用。
　　目的:本課題擬探討ATF3是否參與調(diào)控COPD中MUC5AC（氣道粘液的一種重要組成成分）的表

3、達(dá)，并探索其機(jī)制。
　　方法:檢測(cè)香煙煙霧暴露對(duì)人體氣道上皮細(xì)胞HBE（正常氣道上皮細(xì)胞系），NCI-H292細(xì)胞（人肺粘液表皮樣癌來源細(xì)胞系）和MTEC(小鼠原代氣道上皮細(xì)胞)的ATF3和MUC5AC的表達(dá)影響。利用ATF3小干擾RNA(ATF3 small-interferingRNA，ATF3 siRNA)和ATF3過表達(dá)質(zhì)粒探討ATF3是否與香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)有關(guān)。利用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative

4、 real-time polymerase chainreaction，Q-PCR)，蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot，WB)和免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測(cè)ATF3的缺失或過表達(dá)是否影響香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)。進(jìn)一步利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)及染色體免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation，CHIP)法驗(yàn)證假設(shè)，即A

5、TF3是否通過激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)間接結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域從而調(diào)控其表達(dá)。在體內(nèi)研究中，我們用通過CSE氣道滴注和熏煙制造ATF3基因敲除小鼠(ATF3-/-mice)的COPD模型，從而驗(yàn)證ATF3是否參與調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)中，香煙煙霧能顯著地誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞HBE，NCI-H292和MTEC中ATF3和MUC5AC的表達(dá)。當(dāng)用

6、ATF3 siRNA特異性地敲除ATF3這個(gè)基因后，香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)顯著下降，而白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達(dá)明顯增高。然而，ATF3過表達(dá)質(zhì)粒未對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)產(chǎn)生明顯影響。這一現(xiàn)象提示，ATF3可能并非直接調(diào)控MUC5AC的表達(dá)。Co-IP和CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ATF3通過AP-1信號(hào)通路作用于MUC5AC的啟動(dòng)子區(qū)域，從

7、而間接調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道MUC5AC的表達(dá)。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CSE氣道滴注野生型小鼠(Wild Type mice，WT mice)大氣道MUC5AC的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，然而在ATF3-/-小鼠中氣道MUC5AC的表達(dá)并未明顯下降。這和體內(nèi)的結(jié)果并不一致。然而，在ATF3-/-小鼠模型組中，氣管及血管周圍中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增加。（體內(nèi)模型需進(jìn)一步參照熏煙小鼠的結(jié)果）。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果提示ATF3通過AP