聯(lián)合阻斷CD28-B7和CD40-CD40L對兔高風(fēng)險角膜移植術(shù)后免疫相關(guān)基因的影響.pdf

1、目的：
　　探討共刺激通路CD28-B7和CD40-CD40L在兔高風(fēng)險角膜移植中的作用，通過利用第二代DNA測序技術(shù)，在基因水平探討聯(lián)合阻斷共刺激信號對移植免疫排斥的影響和機制。
　　方法：
　　1.制作動物模型：選擇新西蘭大耳白兔60只，40只為受體兔用于模型制作，20只為角膜移植供體兔。將烏拉坦(3-4ml/kg體重)通過耳緣靜脈注射對兔進(jìn)行全身麻醉，再用0.4％鹽酸奧布卡因滴眼液對右眼表面麻醉，麻醉完成后，用0

2、/5縫線在偏角膜中央?yún)^(qū)均勻縫合4針，板層，針距約5mm。2周后，新生血管形成，均長入中央即可作為高風(fēng)險受體進(jìn)行角膜移植，在拆除縫線2-4天后進(jìn)行穿透性角膜移植手術(shù)。
　　2.實驗動物分組：術(shù)后的實驗動物隨機分成對照組、MR1、抗B7組、聯(lián)合用藥組4組，每組10只。在移植當(dāng)天至術(shù)后第5天各組分別做結(jié)膜下注射，其中對照組:注射生理鹽水；MR1組：注射抗CD40L單克隆抗體(MR1抗體)100μg/d；抗B7組：注射抗B7抗體100μg

3、/d；聯(lián)合用藥組：注射MR1抗體和抗 B7抗體,各100μg/d。
　　3.于術(shù)后4周（28天）或免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時取各組角膜，用Illumina Solexa測序儀進(jìn)行基因譜測定及分析，以比較各組排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度和治療效果的不同。
　　結(jié)果:
　　1.MR1組、抗 B7組和聯(lián)合用藥組均比對照組獲得了較長的角膜存活時間（P<0.05），能夠誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受。聯(lián)合阻斷組存活時間(55.25±7.61)d，較其它3組

4、明顯延長（P<0.05）。MR1組和抗 B7組比較，差別無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　2.基因測序分析表明：?MR1組與對照組標(biāo)本相比差異表達(dá)的基因共有1463條。上調(diào)基因為741條，下調(diào)基因為722條；?抗 B7組標(biāo)本與正常對照組標(biāo)本相比差異表達(dá)的基因共有1367條。上調(diào)基因為618條，下調(diào)基因為749條；?聯(lián)合用藥組與正常對照組標(biāo)本相比差異表達(dá)的基因共有1325條。上調(diào)基因為273條，下調(diào)基因為1052條。?聯(lián)合用藥

5、組與MR1組標(biāo)本相比差異表達(dá)的基因共有1527條。上調(diào)基因為230條，下調(diào)基因為1297條；…聯(lián)合用藥組與抗B7組標(biāo)本相比差異表達(dá)的基因共有1739條。上調(diào)基因為166條，下調(diào)基因為1573條。基因上調(diào)意味著該基因?qū)嶒灲M與對照組相比表達(dá)增強，基因下調(diào)與之相反。通過分析基因表達(dá)情況，可了解其中與免疫排斥相關(guān)的基因如IL-1α、IL-1β、ICAM-1、IL-2在聯(lián)合用藥組比單一用藥組表達(dá)下降，IL-10基因在聯(lián)合用藥組比單一用藥組表達(dá)升高