聯(lián)合阻斷CD28和ICOS抑制兔高危角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜移植失敗最主要原因是術(shù)后免疫排斥反應(yīng)，高危角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)60％。移植免疫學(xué)最新進(jìn)展表明，在移植物排斥的反應(yīng)、發(fā)展過程中，T細(xì)胞的活化是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，共刺激信號(hào)途徑是多樣化的，單純阻斷其中一個(gè)通路雖然能夠在一定程度上抑制急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，但不足以誘導(dǎo)穩(wěn)定、持久的免疫耐受。本實(shí)驗(yàn)擬在兔高危角膜移植模型基礎(chǔ)上，通過聯(lián)合阻斷CD28和ICOS，探討角膜移植中急性排斥反應(yīng)的機(jī)制，以及CTLA～4

2、Ig及：ICOSmAb對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的影響，減少或防止排斥反應(yīng)發(fā)生，提高移植物存活率。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 新西蘭大白兔，體重1.5-2.0kg，年齡8-12周齡，雌雄不限，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 兔高危角膜移植受體模型的建立：肌肉注射氯胺酮(50mg/kg體重)和氯丙嗪(10mg/kg體重)，聯(lián)合0.4％鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，選擇兔右眼用0/5絲線在偏中央角膜基質(zhì)間斷縫合3針

3、，平均分布于角膜，針距5mm，深度達(dá)2/3角膜基質(zhì)層。選擇3個(gè)以上象限角膜有新生血管的兔右眼用于實(shí)驗(yàn)，當(dāng)2周后新生血管距角膜中央7mm以內(nèi)時(shí)拆除縫線，并于2-4d后進(jìn)行穿透性角膜移植術(shù)。 穿透性角膜移植術(shù)(Penetrating keratoplasty，PKP)方法：穿透性角膜移植在角膜縫線拆除2-4d進(jìn)行，同樣，氯胺酮(50mg/kg)和氯丙嗪(10mg/kg)混合肌肉注射全身麻醉，角膜新生血管化兔作為受體，取健康新西蘭白兔

4、作為供體。 植片與植床直徑分別為7.5mm和7.0mm，10-0尼龍線間斷縫合12針至水密狀態(tài)，平衡鹽溶液形成前房。術(shù)后結(jié)膜下注射0.2ml妥布霉素(4mg/ml)，抗生素眼膏涂眼。術(shù)后每天滴0.3％氧氟沙星眼液1次/d，持續(xù)1周。 二、實(shí)驗(yàn)一： 選擇大于3個(gè)象限，新生血管長(zhǎng)入距角膜中央7mm內(nèi)的20只白兔作為高危即新生血管化模型實(shí)驗(yàn)組；20只健康白兔作為非新生血管化模型實(shí)驗(yàn)組；另健康20只白兔雙眼作為供體。分別

5、將新生血管模型組及非新生血管模型組隨機(jī)分成空白對(duì)照組：(植片浸在空白保存液中)(4℃孵育18h)，實(shí)驗(yàn)組：植片浸在含有CTLA-4Ig(10ug/ml)保存液中(4℃孵育18h)。穿透性角膜移植術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片情況。術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)各組4-5只兔的1/2角膜植片分別進(jìn)行組織病理學(xué)和細(xì)胞因子原位雜交檢測(cè)，檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)在角膜植片中的表達(dá)；比較新生血管化與非新生血管化組移植物存活時(shí)間。 三、實(shí)驗(yàn)

6、二： 根據(jù)是否給予ICOSmAb以及應(yīng)用量的多少，隨機(jī)分成5組，每組10只?？瞻讓?duì)照組(空白保存液)、實(shí)驗(yàn)組：A組(1ug/mlICOSmAb)，B組(10ug/mlICOSmAb)C組(25ug/mlICOSmAb)，D組(250ug/mlICOSmAb)。穿透性角膜移植術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片情況。術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)抽取靜脈血0.2ml，肝素抗凝，作T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血液中T淋巴細(xì)胞增值能力；術(shù)后4周或

7、排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)各組的1/2角膜植片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查(HE染色)；術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)抽取房水100ul應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)白細(xì)胞介素2受體(IL-2R)、IL-10的表達(dá)；術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)余1/2角膜植片應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。 四、實(shí)驗(yàn)三： 隨機(jī)將新生血管化角膜模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成4組，每組10只。聯(lián)合阻斷組：植片為浸入含有CTLA-4Ig(10ug/ml)和ICOSmAb(10ug/ml)的

8、保存液中。ICOSmAb組：植片為浸入含有ICOSmAb(10ug/ml)的保存液中。CTLA-4組：植片為浸入含有CTLA-4Ig(10ug/ml)的保存液中。對(duì)照組：?jiǎn)渭冃薪悄ひ浦?，空白保存液。穿透性角膜移植術(shù)后裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片情況。術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)抽取靜脈血0.2ml，肝素抗凝，作淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)血液中T淋巴細(xì)胞增值能力；術(shù)后6周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)各組的1/2角膜植片分別進(jìn)行組織病理學(xué)和細(xì)胞因子原位雜交檢

9、測(cè)，檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)在角膜植片中的表達(dá)：比較各組移植物存活時(shí)間。所用數(shù)據(jù)以x±s表示，采取方差分析q檢驗(yàn)(newman-keuls)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均由spss11.5軟件處理。 結(jié)果： 一、實(shí)驗(yàn)一： (1)在65只新西蘭白兔(65只眼)中僅25只進(jìn)行角膜新生血管化模型制作，20只兔成功誘導(dǎo)角膜新生血管化并作為受體進(jìn)行PKP術(shù)；另5只兔因發(fā)生感染或未達(dá)到模型要求而被淘汰。(2)在非

10、新生血管化角膜移植組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組的植片排斥時(shí)間或平均植片存活時(shí)間上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。超過半數(shù)植片(16/30，53％)存活時(shí)間超過100天。在新生血管化角膜移植組：實(shí)驗(yàn)組孵育于CTLA-4Ig10ug/ml的植片有較長(zhǎng)的生存時(shí)間。(3)新生血管化角膜移植組之組織病理學(xué)HE染色檢查：移植術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)對(duì)照組角膜植片水腫，可見新生血管長(zhǎng)入，角膜基質(zhì)中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核和淋巴細(xì)胞為主，實(shí)驗(yàn)組未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。(4)

11、原位雜交檢測(cè)：移植術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，對(duì)照組角膜植片上皮下基質(zhì)層浸潤(rùn)細(xì)胞有明顯的TNFmRNA的表達(dá)，CTLA-4Ig 10ug/ml實(shí)驗(yàn)組未見TNFmRNA表達(dá)。 二、實(shí)驗(yàn)二： (1)在78只新西蘭白兔(78只眼)中僅53只進(jìn)行角膜新生血管化模型制作，50只兔成功誘導(dǎo)角膜新生血管化并作為受體進(jìn)行PKP術(shù)；另3只兔因發(fā)生感染或未達(dá)到模型要求而被淘汰。(2)實(shí)驗(yàn)組孵育于ICOSmAb 1ug/ml及ICOSmAb 1

12、0ug/ml的植片有較長(zhǎng)的生存時(shí)間，植片平均存活時(shí)間69±34d，75±31d．實(shí)驗(yàn)A、B組和后兩組比較，移植物存活時(shí)間有顯著性差異；而實(shí)驗(yàn)A組和B組比較，移植物存活時(shí)間無(wú)顯著性差異：而實(shí)驗(yàn)A、B組和對(duì)照組比較，移植物存活時(shí)間有顯著性差異。(3)組織病理學(xué)HE染色檢查：移植術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，對(duì)照組及ICOSmAb 250ug/ml實(shí)驗(yàn)組角膜植片水腫，可見新生血管長(zhǎng)入，角膜基質(zhì)中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核和淋巴細(xì)胞為主，ICOS

13、mAb 25ug/ml實(shí)驗(yàn)組可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而其余實(shí)驗(yàn)組未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。(4)移植術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)對(duì)照組及ICOSmAb 250ug/ml實(shí)驗(yàn)組前房水中可以檢測(cè)到IL-2R及IL-10的表達(dá)，ICOSmAb 10ug/ml實(shí)驗(yàn)組未檢測(cè)到IL-2R及IL-10。(5)移植術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，實(shí)驗(yàn)各組與對(duì)照組比較，血液中T淋巴細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差別。（6)移植術(shù)后4周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，對(duì)照組與ICOSmAb 25

14、0ug/ml實(shí)驗(yàn)組CD4<'+>和CD8<'+>T淋巴細(xì)胞表達(dá)均明顯上調(diào)。ICOSmAb 25ug/ml實(shí)驗(yàn)組有一定程度的下調(diào)，與對(duì)照組比較有顯著性差異。CD8<'+>T淋巴細(xì)胞表面ICOS表達(dá)的平均熒光陽(yáng)性百分率結(jié)果顯示：對(duì)照組和ICOSmAb 250ug/ml實(shí)驗(yàn)組之間比較，無(wú)顯著性差異，而與其它三組比較，有顯著性差異。未處理組、ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml實(shí)驗(yàn)組三組間比較，無(wú)顯著性差異。說(shuō)明ICOS

15、在對(duì)照組和ICOSmAb 250ug/ml實(shí)驗(yàn)組表達(dá)上調(diào)，而在ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml實(shí)驗(yàn)組表達(dá)上調(diào)不明顯，而且與CD4<'+>T淋巴細(xì)胞比較，ICOS在CD8<'+>T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)的程度并不明顯。 三、實(shí)驗(yàn)三： (1)在65只新西蘭白兔(65，只眼)中僅45只進(jìn)行角膜新生血管化模型制作，40只兔成功誘導(dǎo)角膜新生血管化并作為受體進(jìn)行PKP術(shù)；另5只兔因發(fā)生感染或未達(dá)到模型要求而

16、被淘汰。(2)聯(lián)合阻斷實(shí)驗(yàn)A組孵育于CTLA-4Ig 10ug/ml和ICOSmAb 10ug/ml的植片有較長(zhǎng)的生存時(shí)間109.33±16.38d，與其他組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ICOSmAb組與CTLA4-Ig組植片存活時(shí)間無(wú)顯著性差異。(3)組織病理學(xué)HE染色檢查：移植術(shù)后6周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，對(duì)照組角膜植片水腫，可見新生血管長(zhǎng)入，角膜基質(zhì)中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核和淋巴細(xì)胞為主，實(shí)驗(yàn)B、C組實(shí)驗(yàn)組可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，實(shí)驗(yàn)A組

17、未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。(4)原位雜交檢測(cè)：移植術(shù)后6周或排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，對(duì)照組角膜植片上皮下基質(zhì)層浸潤(rùn)細(xì)胞有明顯的TNFmRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)B、C組有少許TNFmRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)A組未見TNFmRNA表達(dá)。(5)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血液中T淋巴細(xì)胞增值能力無(wú)差別，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1．阻斷B7/CD28共刺激信號(hào)途徑可以減少或延緩?fù)酶呶＝悄ひ浦裁庖吲懦夥磻?yīng)，誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受。 2．阻斷B7/CD28共