胃癌干細(xì)胞亞群生物學(xué)特性及分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)性死亡的第二原因，盡管有先進(jìn)的診斷工具和治療方法，由于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥，胃癌患者的五年的生存率仍不到30％。因此胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥仍是限制其療效的主要因素。尋找高度特異性治療靶標(biāo)是提高胃癌療效乃至根治的重要途徑，為研究胃癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制開(kāi)辟了新途徑。
　　近年來(lái)興起腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)理論為該途徑提供了新的思路。胃癌干細(xì)胞(gastric cancer stem

2、 cells，GCSCs)是胃癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要因素，對(duì)其進(jìn)行研究，尋找和鑒定特異性的GCSCs的分子標(biāo)志物，并且明確其相關(guān)分子的調(diào)控機(jī)制。
　　在本研究中，我們使用流式細(xì)胞熒光分選和無(wú)血清成球培養(yǎng)的方法，從胃癌細(xì)胞系中分離/富集了胃癌干細(xì)胞亞群CD44和CD90，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)干性相關(guān)基因Sox2、Oct-4和Nanog;無(wú)血清成球培養(yǎng)

3、實(shí)驗(yàn)表明SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的陽(yáng)性細(xì)胞的成球能力明顯強(qiáng)于其陰性細(xì)胞;移植瘤實(shí)驗(yàn)也表明同數(shù)量級(jí)的SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的陽(yáng)性細(xì)胞較其陰性細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力，上述結(jié)果從干性基因表達(dá)、自我更新能力和致瘤性等幾個(gè)主要方面證實(shí)了胃癌細(xì)胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90陽(yáng)性細(xì)胞具有CSCs的特性。
　　體外Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNU-5和SNU-16的GCSCs

4、亞群CD44的陽(yáng)性細(xì)胞較其CD90的陽(yáng)性細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力;而CCK8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明SNU-5和SNU-16的GCSCs亞群CD90的陽(yáng)性細(xì)胞較其CD44陽(yáng)性細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，同時(shí)CD44和CD90陽(yáng)性細(xì)胞的體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CD44陽(yáng)性細(xì)胞形成的移植瘤浸潤(rùn)周圍組織并有肺轉(zhuǎn)移，而CD90陽(yáng)性細(xì)胞形成的移植瘤具有完整的包膜。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CD44陽(yáng)性細(xì)胞呈EMT表型并具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能，CD90陽(yáng)性細(xì)胞呈細(xì)胞周期表型具

5、有高致瘤性的特性。通過(guò)基因芯片分析，我們篩選出在GCSCs亞群CD44和CD90陽(yáng)性細(xì)胞中一系列差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)ENO1在GCSCs亞群CD44陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)增高尤為突出，因此進(jìn)一步研究了ENO1在調(diào)控GCSCs亞群CD44陽(yáng)性細(xì)胞中自我更新及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的分子機(jī)制，并探討了其在胃癌標(biāo)本中表達(dá)的臨床意義。
　　通過(guò)Western Blot檢測(cè)篩選出高表達(dá)ENO1的SNU-5和低表達(dá)ENO1的BGC-823的細(xì)胞模型

6、，同時(shí)流式細(xì)胞熒光分析發(fā)現(xiàn)ENO1在SNU-5的細(xì)胞膜富集表達(dá)，且SNU-5中ENO1與CD44陽(yáng)性細(xì)胞具有共定位現(xiàn)象。利用慢病毒干擾SNU-5中CD44陽(yáng)性細(xì)胞ENO1的表達(dá)后，可以顯著抑制SNU-5中CD44的陽(yáng)性細(xì)胞的成球能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力;發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ENO1后增強(qiáng)BGC-823中CD44陽(yáng)性細(xì)胞的成球能力、成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力。另外，本室制備靶向ENO1的功能性單抗21A3對(duì)SNU-5中CD44陽(yáng)性細(xì)胞體外功能的影響

7、實(shí)驗(yàn)表明，單抗21A3可以顯著抑制SNU-5中CD44的陽(yáng)性細(xì)胞的成球和侵襲能力。對(duì)SNU-5中CD44陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞進(jìn)行基因芯片及信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路改變最大。Western blot檢測(cè)在穩(wěn)定干擾ENO1的SNU-5中CD44陽(yáng)性細(xì)胞的EMT標(biāo)志物Vimentin表達(dá)降低及細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和C-myc的下調(diào)表達(dá)，以此同時(shí)E-cadherin和p21的上調(diào)表達(dá)，伴隨PI3K/Akt信號(hào)通路Akt

8、和PI3K的磷酸化水平降低，膜ENO1和膜uPA蛋白也伴隨下調(diào)，而過(guò)表達(dá)ENO1的BGC-823中CD44陽(yáng)性細(xì)胞Akt和PI3K的磷酸化水平上升，同時(shí)膜ENO1和膜uPA蛋白也表達(dá)上升，提示ENO1的作用可能通過(guò)Akt信號(hào)通路激活。對(duì)95例胃癌標(biāo)本免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果顯示，與ENO1的表達(dá)成正相關(guān)，而與患者的生存時(shí)間成負(fù)相關(guān)，ENO1可以作為判斷胃癌預(yù)后的重要指標(biāo)。
　　本文的主要結(jié)論如下:流式熒光分選和無(wú)血清成球培養(yǎng)是一種能夠