microRNAs在自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)發(fā)育中的作用.pdf

1、自然殺傷T細(xì)胞（NaturekillerTcell，NKT）是在T淋巴細(xì)胞發(fā)育早期中出現(xiàn)的特殊類型的T淋巴細(xì)胞亞群。既往研究發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞在機(jī)體微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)，腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病及多種皮膚科疾病的發(fā)生中具有重要作用。NKT細(xì)胞表現(xiàn)出T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（Naturekillercell，NK）的特性，在功能上NKT細(xì)胞具有T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)又兼具NK細(xì)胞的自然殺傷作用。NKT細(xì)胞是溝通天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁，但對(duì)于N

2、KT細(xì)胞發(fā)育成熟的調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不清晰。
　　microRNA是新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的短鏈編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約22堿基（nt），可以通過與靶基因特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶mRNA進(jìn)行降解、翻譯抑制發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。microRNA參與免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，發(fā)育和分化，并影響免疫細(xì)胞的功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠造血干細(xì)胞系Dicer裂解酶，造成小鼠造血系統(tǒng)缺乏成熟microRNAs，繼而發(fā)現(xiàn)胸腺細(xì)胞中NKT細(xì)胞的

3、發(fā)育和成熟明顯受到抑制，但傳統(tǒng)T細(xì)胞不受明顯影響。目前關(guān)于microRNA在NKT細(xì)胞發(fā)育中作用的研究甚少，尚無單個(gè)microRNA對(duì)NKT細(xì)胞發(fā)育的相關(guān)研究。
　　基于本課題組先前的研究基礎(chǔ)，為繼續(xù)深入探究單個(gè)microRNA在NKT細(xì)胞發(fā)育及功能的作用，課題組使用流式細(xì)胞分選儀分選不同發(fā)育階段NKT細(xì)胞，通過microarray技術(shù)分析在不同發(fā)育階段的NKT中microRNAs的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)miR155和miR223特異性高

4、表達(dá)于NKT細(xì)胞發(fā)育不成熟階段(階段1CD44lowNK1.1-和階段2CD44highNK1.1-)，而在成熟階段（階段3CD44highNK1.1+）表達(dá)明顯降低。這些結(jié)果推測(cè)miR155和miR223可能對(duì)NKT細(xì)胞的發(fā)育成熟，并可能影響了細(xì)胞的功能，但目前缺乏確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　研究目的與方法
　　為探究miR155和miR223在NKT細(xì)胞發(fā)育成熟和功能中的作用，本課題以miR223敲除（KO）小鼠，miR155

5、敲除（KO）小鼠和造血干細(xì)胞特異性miR155轉(zhuǎn)基因（KI）小鼠為研究對(duì)象，觀察在特異性改變miR155及miR223表達(dá)水平的情況下，NKT細(xì)胞的發(fā)育成熟以及其功能是否出現(xiàn)異常變化。使用裝載了α-GalCer的CD1d四聚體（α-GalCer-CD1dtetramers）的特異性抗體標(biāo)記NKT細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NKT細(xì)胞在不同淋巴器官中的數(shù)目，同時(shí)檢測(cè)NKT細(xì)胞成熟細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平。分別使用α-GalCer體內(nèi)注射或PMA/I

6、onomycin體外刺激NKT細(xì)胞，檢測(cè)NKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能。
　　研究結(jié)果
　　1）在miR223KO小鼠模型中，NKT細(xì)胞發(fā)育成熟與功能的變化
　　研究結(jié)果顯示，與野生型（WT）小鼠相比，在miR223-/YKO小鼠中傳統(tǒng)型T細(xì)胞各細(xì)胞亞群的比率為發(fā)生明顯改變，miR223-/YKO小鼠與WT小鼠CD4+細(xì)胞亞群所占比率分別為10.56％vs.11.35％，CD8+細(xì)胞亞群5.02％vs.5.71％，CD4

7、+CD8+雙陽性占81.60％vs.80.65％，CD4-CD8-雙陰性所占比率2.83％vs.2.30％。胸腺、脾臟、肝臟、外周淋巴結(jié)及骨髓中NKT細(xì)胞的數(shù)目未發(fā)生明顯變化（胸腺：0.15±0.02％vs.0.15±0.01％，P=0.805，脾臟：0.80±0.14％vs.0.73±0.13％，P=0.715，肝臟：14.67±3.51％vs.13.37±2.83％，P=0.764，外周淋巴結(jié)：0.12±0.05％vs.0.14±0

8、.03％，P=0.557，骨髓：0.99±0.44％vs.1.71±0.58％，P=0.376）。
　　在NKT細(xì)胞三個(gè)發(fā)育成熟階段中，包括階段1CD44lowNK1.1-、階段2CD44highNK1.1-及階段3CD44highNK1.1+，WT小鼠中胸腺NKT細(xì)胞與miR223-/Y敲除小鼠相比，在三個(gè)發(fā)育階段各占的比率在階段1為5..59±0.92％vs.6.57±2.32％，P=0.781，在階段2分別為15.59±4.

9、44％vs.13.08±2.39％,P=0.593，在階段3的NKT細(xì)胞分別為77.83±4.69％vs.78.71±3.85％，P=0.894。；NKT細(xì)胞成熟細(xì)胞表面標(biāo)記物（包括Ly49G2，CD69，CD24及CD122）的表達(dá)均無明顯異常。在外周淋巴器官中也觀察到了同樣的結(jié)果，NKT細(xì)胞中NK1.1+的比率無明顯差異。
　　經(jīng)α-GalCer體內(nèi)注射以及PMA/Ionomycin體外刺激NKT細(xì)胞，miR223-/Y敲除小

10、鼠NKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IL-4、IFN-γ）與野生型小鼠相比未發(fā)現(xiàn)明顯異常。
　　2）在miR155KO小鼠模型中，NKT細(xì)胞發(fā)育成熟與功能的變化
　　在miR155敲除小鼠各個(gè)淋巴器官中NKT細(xì)胞數(shù)目不發(fā)生明顯變化，野生型小鼠與miR155KO小鼠相比，胸腺NKT細(xì)胞所占比率為0.32±0.02％vs.0.30±0.04％，P=0.745。脾臟NKT細(xì)胞占B220陰性細(xì)胞的0.83±0.12％vs.0.83±0.13％

11、，P=0.987。肝臟NKT細(xì)胞占B220陰性細(xì)胞的17.19±2.35％vs.11.63±1.26％，P=0.694。
　　miR155敲除小鼠胸腺中NKT細(xì)胞的發(fā)育正常，miR155敲除小鼠中胸腺NKT細(xì)胞在三個(gè)發(fā)育階段各占的比率與野生小鼠中胸腺NKT細(xì)胞相比無明顯差異。野生型(WT)小鼠microRNA155-/-小鼠在三個(gè)發(fā)育階段各占的比率在階段1分別為12.94±2.90％vs.12.73±3.49％，P=0.965，在

12、階段2分別為17.36±2.12％vs.14.88±2.23％,P=0.439，在階段3的NKT細(xì)胞分別為63.53±6.54％vs.64.94±6.75％，P=0.894。兩者之間無顯著差異。
　　NKT細(xì)胞成熟細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)均無明顯異常。在外周淋巴器官中NKT細(xì)胞的進(jìn)一步成熟也未出現(xiàn)異常，NK1.1陽性NKT細(xì)胞的比率無明顯差異。
　　3）在造血干細(xì)胞特異性miR155KI小鼠中，NKT細(xì)胞發(fā)育成熟與功能的變化

13、r>　　與WT小鼠相比，miR155KI小鼠胸腺、脾臟、肝臟、外周淋巴結(jié)及骨髓中NKT細(xì)胞的數(shù)目未發(fā)生明顯變化。野生型小鼠與miR155KI小鼠相比，胸腺NKT細(xì)胞所占比率為0.17±0.04％vs.0.20±0.04％，P=0.616。脾臟NKT細(xì)胞占B220陰性細(xì)胞的0.85±0.14％vs.0.66±0.10％，P=0.314。肝臟NKT細(xì)胞占B220陰性細(xì)胞的18.70±4.53％vs.15.31±2.08％，P=0.522。淋

14、巴結(jié)中NKT細(xì)胞占B220陰性細(xì)胞的0.16±0.03％vs.0.19±0.02％，P=0.464。在各個(gè)淋巴器官中，NKT細(xì)胞的比率未發(fā)現(xiàn)存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　在miR155KI小鼠胸腺內(nèi)NKT細(xì)胞發(fā)育阻滯在階段2即CD44highNK1.1-階段，缺少成熟NKT細(xì)胞。野生型小鼠與miR155KI小鼠胸腺NKT細(xì)胞在三個(gè)發(fā)育階段1分別為6.56±1.29％vs.13.01±2.91％，P=0.077，在階段2分別為21.43

15、±6.65％vs.63.82±5.10％,P<0.001，在階段3的NKT細(xì)胞分別為69.03±9.37％vs.15.93±2.59％，P<0.001。與野生型小鼠相比，在miR155KI小鼠胸腺內(nèi)NKT細(xì)胞發(fā)育阻滯在階段2即CD44highNK1.1-階段，缺少成熟NKT細(xì)胞，NKT細(xì)胞發(fā)育成熟明顯滯后。
　　miR155KI小鼠的胸腺中NKT細(xì)胞成熟細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平降低。NKT細(xì)胞表達(dá)分子CD122、CD6、LY49C陽性比

16、率分別為15.69±4.12％、26.25±3.87％、4.43±1.45％，均分別低于WT小鼠（71.59±5.03％、64.42±4.07％，38.03±3.44％），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.0001）。miR155KI小鼠的在外周淋巴器官中NKT細(xì)胞中表面成熟標(biāo)記NK1.1的表達(dá)均顯著低于同窩的野生型小鼠,NKT細(xì)胞的成熟也明顯阻滯。在4～6周齡miR155KI小鼠中NKT細(xì)胞的增殖和凋亡比率均顯著增加。
　　經(jīng)α-GalC

17、er體內(nèi)注射后，與野生型小鼠相比，miR155小鼠NKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞內(nèi)因子IL-4（34.73％vs.9.09％）及IFN-γ（47.94％vs.16.51％）水平明顯降低；但經(jīng)PMA/Ionomycin體外刺激NKT細(xì)胞，可以可恢復(fù)NKT細(xì)胞分泌IL4的水平(60.00％vs.55.55％)；miR155KI小鼠IFN-γ水平顯著降低（70.00％vs.39.00％）。
　　研究結(jié)論：
　　1）miR223的缺失不影響N

18、KT細(xì)胞在胸腺及外周淋巴器官的發(fā)育成熟，同時(shí)NKT細(xì)胞的功能不受明顯影響。
　　2）miR155的缺失也不影響NKT細(xì)胞的發(fā)育成及功能。
　　3）miR155的增加會(huì)顯著影響NKT細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致成熟明顯滯后。并且可以顯著降低NKT的功能及其細(xì)胞因子的分泌表達(dá)，分泌軸偏向Th2類細(xì)胞因子。
　　基于目前我們的研究結(jié)果，miR155和miR223的缺失并不會(huì)影響NKT細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育成熟，也不影響NKT細(xì)胞在外周淋巴器官