Invariant NKT細(xì)胞在慢性HBV感染中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染可引起一系列肝臟疾病，包括無(wú)癥狀攜帶、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)、肝硬化和肝癌。全世界有超過(guò)3億人為慢性HBV感染，其中約三分之一在中國(guó)。在我國(guó)，每年因HBV感染相關(guān)肝病死亡的患者達(dá)30萬(wàn)人。目前尚無(wú)能徹底清除HBV的理想藥物，因此HBV感染已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 HBV感染后肝細(xì)胞的損傷并

2、不是由HBV的入侵、復(fù)制直接造成的，而主要是由宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別病毒感染細(xì)胞后引起的免疫殺傷。不僅如此，機(jī)體的免疫功能在很大程度上還決定了抗病毒治療的效果。對(duì)抗病毒治療無(wú)應(yīng)答者，機(jī)體抗HBV免疫應(yīng)答能力持續(xù)低下;而完全應(yīng)答者其抗病毒免疫應(yīng)答能力顯著升高，即機(jī)體的免疫系統(tǒng)在HBV慢性感染的病程和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。
　　 機(jī)體的免疫可分為天然免疫(亦稱(chēng)固有免疫或非特異性免疫)和適應(yīng)性免疫(亦稱(chēng)獲得性免疫或特異性免疫)兩類(lèi)。天然免疫

3、是機(jī)體抵御感染的第一道防線(xiàn)，由物理、化學(xué)屏障(如皮膚、粘膜、胃酸等)，吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)，體液因子(補(bǔ)體、溶菌酶、細(xì)胞因子等)，NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞等組成。天然免疫能非特異性識(shí)別并清除入侵的病原體，并在適應(yīng)性免疫的啟動(dòng)、效應(yīng)階段發(fā)揮重要作用，還參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。在生理性免疫應(yīng)答和某些病理性免疫過(guò)程中，天然免疫都處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 InvariantNKT(invariantNKT)細(xì)胞是天然免疫的重要組成細(xì)胞，

4、最早于1987年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。invariantNKT細(xì)胞與傳統(tǒng)T細(xì)胞的主要區(qū)別在于:①invariantNKT細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)比較保守，多樣性高度受限。在小鼠主要為Vα14-Jα18/Vβ8.2、Vβ7和Vβ2，在入主要為Vα24-Jα18/Vβ11。②與傳統(tǒng)T細(xì)胞主要識(shí)別MHC分子遞呈的抗原肽不同，invariantNKT細(xì)胞識(shí)別的是MHC(Ⅰ)類(lèi)樣分子CD1d遞呈的脂類(lèi)或糖脂類(lèi)抗原。③invariantNKT細(xì)胞活化后

5、能迅速(數(shù)小時(shí)內(nèi))分泌大量的Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子。invariantNKT細(xì)胞在外周血、淋巴結(jié)中比例很低，約占淋巴細(xì)胞的0.5％，但其在肝內(nèi)卻異常豐富，占肝內(nèi)淋巴細(xì)胞的比例在小鼠高達(dá)40％，在人體也在12％左右。結(jié)構(gòu)決定功能，肝內(nèi)如此豐富的invariantNKT細(xì)胞在HBV慢性感染過(guò)程中發(fā)揮何種作用？HBV慢性感染是否對(duì)invariantNKT細(xì)胞的功能有影響？這種影響有何臨床意義？在抗病毒治療過(guò)程中，invariantNKT細(xì)胞

6、的功能有何變化？對(duì)優(yōu)化治療方案有何意義？對(duì)于這些問(wèn)題，目前的研究還未能給出清晰的答案。鑒于此，本研究比較了慢性HBV感染后不同疾病狀態(tài)下患者外周血invariantNKT細(xì)胞的比例、表型及功能的變化;分析其與病毒復(fù)制和肝臟炎癥的相關(guān)性;觀(guān)察抗病毒治療后這群細(xì)胞的變化規(guī)律;通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)揭示invariantNKT細(xì)胞參與慢性HBV感染的潛在機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.研究對(duì)象
　　 本研究共納入35例CHB患者

7、，其中一部分來(lái)自南方醫(yī)院感染內(nèi)科住院患者，一部分來(lái)自參加替比夫定抗病毒治療的臨床試驗(yàn)患者;15例免疫耐受期的HBV攜帶者(ImmunotolerantCarrier，IT)和25例非活動(dòng)性HBsAg攜帶者(InactiveCarrier，IC)，主要為2009年12月至2011年4月南方醫(yī)院感染內(nèi)科門(mén)診病人以及義診患者;以及36例健康成人(HealthyControl，HC)，主要為南方醫(yī)院肝病中心實(shí)驗(yàn)室工作人員、在讀研究生和南方醫(yī)科大

8、學(xué)學(xué)生。
　　 2.血清學(xué)和病毒學(xué)檢測(cè)
　　 用商品化的AxSYMMEI試劑盒(AbbottLaboratories，NorthChicago，IL)檢測(cè)乙肝兩對(duì)半、抗-HCV和抗HDV。用羅氏CobasTaqman48(Meylan,France)定量檢測(cè)血漿中的HBVDNA，其最低檢測(cè)下限為300拷貝/ml。此部分檢測(cè)由南方醫(yī)院肝病中心臨床檢測(cè)室完成。
　　 3.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離
　　

9、 每例研究對(duì)象在入組時(shí)，用肝素鈉抗凝管采集靜脈血10-30ml。19例接受替比夫定抗病毒治療的CHB患者在治療后的第12周、24周和52周再另外抽取10-30ml靜脈血。用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM)
　　 用無(wú)菌PBS調(diào)整PBMC到合適濃度，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌流式管。加入熒光標(biāo)記抗體，用FCM檢測(cè)invariantNKT細(xì)胞的頻數(shù)和相關(guān)受

10、體的表達(dá)。在某些情況下，先用PMA對(duì)PBMC進(jìn)行刺激，然后收集細(xì)胞，用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)invariantNKT細(xì)胞及其他細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況。
　　 5.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
　　 用Transwell系統(tǒng)檢測(cè)趨化因子5(CCL5)和趨化因子20(CCL20)對(duì)invariantNKT細(xì)胞的趨化作用。將新鮮分離的PBMC置于上室，下室加入一定濃度的CCL5或CCL20，37℃培養(yǎng)10小時(shí)。收集上、下室的細(xì)胞，用FCM檢測(cè)i

11、nvariantNKT細(xì)胞的比。
　　 6.invariantNKT細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)
　　 將新鮮分離的PBMC用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1×106個(gè)/ml，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200μl/孔。加入α-GalCer(invariantNKT細(xì)胞的特異性刺激劑)和重組人IL-21(rhlL-21)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。收集細(xì)胞，用FCM檢測(cè)invariantNKT細(xì)胞的增值情況。
　　 7.E

12、LISPOT
　　 將新鮮分離的PBMC置于預(yù)先包被有鼠抗人IFN-γ的ELISPOT板，加入α-GalCer和rhIL-21，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。棄細(xì)胞，然后加入生物素標(biāo)記的另一鼠抗人IFN-γ抗體，反應(yīng)完成后再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素。加入底物顯色，觀(guān)察、記錄結(jié)果。
　　 在某些情況下，用B細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)invariantNKT細(xì)胞活化對(duì)HBV特異性抗體產(chǎn)生的影響。具體步驟如下:ELISPOT板預(yù)

13、包被重組HBeAg或HBcAg，然后加入PBMC，用α-GalCer刺激60小時(shí)。棄細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的羊抗人IgG，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后加入親和素-堿性磷酸酶，加底物顯色。
　　 8.肝內(nèi)invariantNKT細(xì)胞的檢測(cè)
　　 用無(wú)菌手術(shù)剪將新鮮切除的肝組織(來(lái)源于肝臟手術(shù)病人)剪成小塊，加入組織消化液室溫消化1小時(shí)。濾膜過(guò)濾，然后用人淋巴細(xì)胞分離液分離肝內(nèi)淋巴細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)肝內(nèi)invariantNKT細(xì)胞的

14、比例。
　　 9.免疫組織化學(xué)染色
　　 將肝穿組織或手術(shù)切除肝組織經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟后制成石蠟切片。用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝內(nèi)invariantNKT細(xì)胞的頻數(shù)及分布。
　　 10.統(tǒng)計(jì)分析
　　 用GraphPadPrism5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組間的結(jié)果比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。同一研究對(duì)象不同時(shí)間或劑量的比較用重復(fù)測(cè)量的方差分析。計(jì)數(shù)資料的比較用Fisher'sexa

15、cttest。相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。用受試者工作特征曲線(xiàn)(ROC曲線(xiàn))比較不同參數(shù)對(duì)替比夫定抗病毒治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測(cè)價(jià)值。雙側(cè)檢驗(yàn)、P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.CHB患者外周血invariantNKT細(xì)胞比例顯著下降
　　 我們首先比較、分析了invariantNKT細(xì)胞在CHB患者、HBV攜帶者以及健康人外周血中占CD3+T細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，在健康

16、成人外周血中，invariantNKT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例中位數(shù)(最小值，最大值)為0.24％(0.064％-0.81％)。HBV感染后，在HBV特異性免疫還沒(méi)起來(lái)的IT期，invariantNKT細(xì)胞比例升高至0.39％(0.203％-0.96％)，顯著高于健康對(duì)照(P＜0.01)。在CHB患者，其HBV特異性免疫已被激發(fā)，外周invariantNKT細(xì)胞的比例下降至0.129％(0.027％-1.071％)，顯著低于IT(P＜

17、0.001)，甚至比健康對(duì)照還要低(P=0.0143)。而在HBV受到免疫控制的IC期，invariantNKT細(xì)胞的比例得到一定恢復(fù)，為0.19％(0.06％-1.38％)，顯著高于CHB患者(P=0.0235)，雖然比健康人略低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也要顯著低于IT(P＜0.001)。
　　 2.IT期CD4-invariantNKT細(xì)胞的比例與病毒載量呈正相關(guān)
　　 我們對(duì)30例CHB患者進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分

18、析，結(jié)果顯示，invariantNKT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例與血漿中的病毒滴度和ALT水平并沒(méi)有明顯的相關(guān)性。進(jìn)一步將invariantNKT細(xì)胞分為CD4-和CD4+兩個(gè)亞群分析，在IT期，HBVDNA滴度與CD4-NKT細(xì)胞的比例呈明顯的正相關(guān)(r=0.928，P=0.008)，而與CD4+invariantNKT細(xì)胞比例和總的invariantNKT細(xì)胞比例無(wú)明顯相關(guān)性。
　　 3.替比夫定抗病毒治療后外周血invar

19、iantNKT細(xì)胞的比例升高
　　 19例CHB患者在抗病毒治療前(Baseline)其外周血invariantNKT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例為0.18％(0.03％-1.07％);接受抗病毒治療后的12W，比例為0.21％(0.04％-1.43％)，顯著高于Baseline(P=0.0231);治療24w后，比例為0.20％(0.04％-1.49％)，高于Baseline，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08);治療52w后，in

20、variantNKT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例為0.21％(0.05％-1.22％)，也是顯著高于Baseline的(P＜0.01)。治療后12W、24W和52W之間互相是沒(méi)有顯著性差異的。
　　 4.CHB患者基線(xiàn)invariantNKT細(xì)胞亞群比例能預(yù)測(cè)替比夫定治療52W后e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換
　　 在19例接受替比夫定抗病毒治療的CHB患者中，有7例(36.84％)在治療52W后發(fā)生了e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換。在治療過(guò)程中，無(wú)

21、論轉(zhuǎn)換組還是非轉(zhuǎn)換組，患者血漿中的HBVDNA滴度都是下降的，但兩者下降的趨勢(shì)不一樣。非轉(zhuǎn)換組在治療后的前12W，病毒滴度快速下降至4-5log，然后在這個(gè)較高的病毒水平上維持相對(duì)的穩(wěn)定。而轉(zhuǎn)換組在治療后的前12W，病毒滴度快速下降至3-4log，然后隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度繼續(xù)下降至3個(gè)log以下。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在替比夫定抗病毒治療后的24W和52W，轉(zhuǎn)換組的HBVDNA水平是顯著低于非轉(zhuǎn)換組的(12W，P＜0.05，52W，P＜

22、0.01)。在基線(xiàn)，轉(zhuǎn)換組的ALT水平(U/L)為188.9±78.17，雖然高于非轉(zhuǎn)換組(128.2±98.84)，但由于例數(shù)較少，并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.1082)?？共《局委熀?，無(wú)論是轉(zhuǎn)換組還是非轉(zhuǎn)換組，其血清ALT水平都是持續(xù)下降的。
　　 把19例接受替比夫定抗病毒治療的患者按基線(xiàn)CD4-/CD4+invariantNKT細(xì)胞的比值分成兩組:高比例組(≧1)和低比例組(＜1)。然后比較兩組抗病毒治療52W后e抗原血清

23、學(xué)轉(zhuǎn)換情況。結(jié)果顯示，高比例組(n=12)中有7例(58.33％)發(fā)生了血清學(xué)轉(zhuǎn)換，顯著高于低比例組。ROC曲線(xiàn)下面積為0.75(95％CI，0.502-0.917)，能用于預(yù)測(cè)治療52W后的e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換(P=0.04)。CD4-/CD4+invariantNKT細(xì)胞比值在0.94時(shí)具有最好的預(yù)測(cè)效果(敏感性100％，特異性58.6％)。
　　 5.活化的invariantNKT細(xì)胞能促進(jìn)e抗體分泌細(xì)胞的產(chǎn)生
　　

24、用α-GalCer刺激新鮮分離的PBMC(來(lái)自于IC攜帶者)，用ELISPOT檢測(cè)其對(duì)e抗體分泌細(xì)胞產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，不加α-GalCer刺激時(shí)，有2例(40％)IC可以用ELIPOT檢測(cè)出e抗體分泌細(xì)胞;加入100ng/ulα-GalCer刺激60h后，有4例(80％)可檢測(cè)出e抗體分泌細(xì)胞，且前面?zhèn)z例不加α-GalCer刺激也能檢測(cè)出的在加了α-GalCer刺激后，e抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量也是增多的。統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示α-GalCer刺

25、激能顯著增加IC攜帶者PBMC中e抗體分泌細(xì)胞的產(chǎn)生(P＜0.05)。我們還用雅培AxSYMMEIkits半定量檢測(cè)了α-GalCer刺激60h后的上清中e抗體的水平，發(fā)現(xiàn)5份樣本中只有一份檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
　　 6.IL-21能抑制α-GalCer對(duì)invariantNKT細(xì)胞的增值
　　 我們前期的研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血中invariantNKT細(xì)胞的比例是降低的，而血清中IL-21濃度是升高的。考慮到inv

26、ariantNKT細(xì)胞是IL-21重要的分泌細(xì)胞，我們推測(cè)IL-21濃度的升高可能會(huì)反饋抑制invariantNKT細(xì)胞的增值。我們用α-GalCer在體外刺激新鮮分離的CHB患者的PBMC，7天后收集細(xì)胞，流式檢測(cè)invariantNKT細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示其比例為0.59±0.28％，明顯高于未刺激組(0.28±0.18％，P＜0.05)。如果在加入α-GalCer刺激的同時(shí)，加入終濃度為100ng/mlrhIL-21，刺激7天后，

27、invariantNKT細(xì)胞的比例為0.25％±0.17％，顯著低于α-GalCer單獨(dú)刺激組(P＜0.05)，但與未刺激組相比無(wú)明顯差異。
　　 收集培養(yǎng)上清，用FlowCytomix檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞因子的濃度。不加IL-21刺激，上清中IL-10的濃度為23.87±14.96pg/ml，IL-6的濃度為577.2±892.9pg/ml，IL-1β的濃度為18.92±4.16pg/ml。10ng/ml的IL-21刺激后，

28、上清中IL-10的濃度為109.54±21.31pg/ml，顯著高于未刺激組(P＜0.05);IL-6的濃度為1467.5±680pg/ml，顯著高于未刺激組(P＜0.05);IL-1β的濃度為50.13±28.444pg/ml，顯著高于未刺激組(P＜0.05)。100ng/mlIL-21刺激后，上清中IL-10的濃度為378±266.9pg/ml，顯著高于未刺激組(P=0.0022)和10ng/mlIL-21刺激組(P＜0.05);I

29、L-6的濃度為5640±1165pg/ml，顯著高于未刺激組(P=0.0087)和10ng/mlIL-21刺激組(P＜0.05);IL-1β的濃度為315.8±142.4pg/ml，顯著高于未刺激組(P=0.0095)和10ng/mlIL-21刺激組(P＜0.05)。IL-21刺激后，TNF-α的濃度也有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們用FlowCytomix還檢測(cè)了培養(yǎng)上清中IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-8、IL-4、IL-

30、5和TNF-β的濃度，發(fā)現(xiàn)IL-21刺激組和未刺激組間無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.我們的橫向研究結(jié)果顯示外周血invariantNKT細(xì)胞的比例在慢性HBV感染中有一個(gè)升高、降低、恢復(fù)的過(guò)程，表明invariantNKT細(xì)胞參與了慢性HBV感染的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，且與病毒復(fù)制和肝內(nèi)炎癥相關(guān)。
　　 2.CHB患者外周血invariantNKT細(xì)胞比例的降低可能與其高表達(dá)CCR5和CCR6相關(guān)，即因肝內(nèi)炎癥