基于A20基因?yàn)樗幬锇械娜斯や\指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計(jì).pdf

1、研究的背景和目的： A20(tumornecrosisfactor，alpha-inducedprotein3，TNFAIP3)基因是腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導(dǎo)下的即早反應(yīng)基因，其表達(dá)產(chǎn)物屬于胞漿內(nèi)的一種鋅指類瞬時(shí)調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，A20可抑制不同細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、NF-κB等)及基因活化引起的細(xì)胞凋亡、過(guò)度的炎癥反應(yīng)、免疫排斥、甚至可影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸等。在成纖維細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、WEHI164細(xì)胞、NIH3T

2、3細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)A20蛋白可抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。實(shí)驗(yàn)證明，A20基因缺陷小鼠在出生一周就顯現(xiàn)明顯的發(fā)育不全，很快出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及惡病質(zhì)，對(duì)LPS及TNF高度敏感，并過(guò)早死亡。 隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，人工干預(yù)內(nèi)源性基因表達(dá)的方法越來(lái)越多，如基因敲除與敲入、反義技術(shù)、核酶技術(shù)、人工轉(zhuǎn)錄因子(artificialtranscriptionfactor，ATF)、以及近期發(fā)展起來(lái)的RNA干擾技術(shù)等。不同技術(shù)的優(yōu)

3、缺點(diǎn)存在很大差別，如基因敲除，其技術(shù)手段先進(jìn)，特異性強(qiáng)，但步驟煩瑣，技術(shù)條件要求非常高，并非一般實(shí)驗(yàn)室容易開展。各種反義技術(shù)多是在基因轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行調(diào)控，其作用往往限于抑制基因的表達(dá)，而且需要針對(duì)大量的靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)。ATF技術(shù)則是通過(guò)體外構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子，入核后識(shí)別DNA上的特異性核酸位點(diǎn)，對(duì)特定基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，因此利用少量的人工轉(zhuǎn)錄因子往往就能起到很好的調(diào)控效果。其作用效果不但能抑制或減弱特定基因的表達(dá)，也可以啟動(dòng)靶基因的過(guò)表達(dá)

4、。一個(gè)合適的人工轉(zhuǎn)錄因子甚至可以調(diào)節(jié)某個(gè)基因家族或是整條代謝通路中的一系列相關(guān)產(chǎn)物，因此人工轉(zhuǎn)錄因子在基礎(chǔ)研究、腫瘤等疾病的基因治療與抗病毒治療等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。 轉(zhuǎn)錄因子通常由兩個(gè)非常重要的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(EffecterDomain，ED)。前者具有與特定DNA結(jié)合的特性，后者則發(fā)揮效應(yīng)作用。由于人工轉(zhuǎn)錄因子可以進(jìn)行模塊化設(shè)計(jì)，通過(guò)改變DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以靈

5、活選擇其作用靶位，改變其效應(yīng)結(jié)構(gòu)域則可以對(duì)于目的基因進(jìn)行激活、抑制、甲基化等不同的調(diào)控，應(yīng)用十分靈活方便。實(shí)驗(yàn)證明，可把兩類不同的結(jié)構(gòu)域以模塊形式在體外相互組合，構(gòu)建新型的人工轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)。在人工轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計(jì)過(guò)程中，構(gòu)建能夠識(shí)別特定基因序列的DNA結(jié)合域是最重要的工作。近年來(lái)，用鋅指蛋白作為工具來(lái)調(diào)控哺乳動(dòng)物特定基因表達(dá)的研究有了較大發(fā)展，研究方法主要是通過(guò)設(shè)計(jì)鋅指蛋白中的DNA結(jié)合區(qū)域來(lái)識(shí)別特定的DNA序列，通常

6、為特定基因的啟動(dòng)子序列，進(jìn)而通過(guò)與其融合設(shè)計(jì)的效應(yīng)域?qū)υ摶蜻M(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活或抑制。研究證明，Cys2-His2鋅指蛋白可作為DNA結(jié)合域的一種理想的結(jié)構(gòu)框架。一般來(lái)講，一個(gè)典型的鋅指蛋白DNA結(jié)合域通常由3個(gè)或6個(gè)鋅指組成。目前，人工鋅指蛋白(artificialzincfingerprotein，AZP)技術(shù)使人們可直接選擇不同的DNA序列，從而設(shè)計(jì)出相應(yīng)的DNA結(jié)合域。 人類基因組計(jì)劃所推動(dòng)的大規(guī)模DNA測(cè)序，為生物醫(yī)藥工業(yè)提

7、供了大量可用于新藥開發(fā)的原材料。生物信息學(xué)為分子生物學(xué)家提供了大量對(duì)基因序列進(jìn)行分析的工具，不但可以從資料的獲取、基因功能的預(yù)測(cè)、藥物篩選過(guò)程中的信息處理等方面大大加快新藥開發(fā)的進(jìn)程，而且可以大大加快傳統(tǒng)的基因發(fā)現(xiàn)和研究，因而成為各贏利性研究機(jī)構(gòu)和醫(yī)藥公司爭(zhēng)奪基因?qū)＠闹匾ぞ?。人類基因組測(cè)序的推動(dòng)者塞萊拉公司宣布，將集中精力挖掘蘊(yùn)涵在基因序列中的信息，尋找制藥的“靶點(diǎn)”。 本研究的主要方法和結(jié)果： 1.確定并克隆A20

8、基因上游假定啟動(dòng)子序列： 利用生物信息學(xué)手段對(duì)A20基因上游序列進(jìn)行分析，顯示A20基因上游-1000～+300序列系GC富集區(qū)，存在諸多反式作用因子結(jié)合元件，并確定基因組NC_000006138230088處堿基“C”為A20基因的TSS。利用Gene2Promoter數(shù)據(jù)包以及McPromoter服務(wù)器分析A20基因假定啟動(dòng)子范圍，確定基因組NC_000006138229786～138230182間的序列作為A20基因的假定

9、啟動(dòng)子研究序列。 采用巢式PCR方法從人基因組DNA中克隆了A20基因假定啟動(dòng)子序列，亞克隆到pGL3載體中。通過(guò)雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析，證明獲取的假定啟動(dòng)子序列具有啟動(dòng)子活性。 2.設(shè)計(jì)可特異性結(jié)合A20基因上游啟動(dòng)子區(qū)的人工鋅指蛋白ZFP： 登陸Scripps的ZFtools服務(wù)器，提交獲得的A20基因假定啟動(dòng)子序列，設(shè)定各種參數(shù)后，獲得了A20基因上游特定靶序列及相應(yīng)的人工鋅指蛋白(zincfingerpr

10、otein，ZFP)序列。利用不同生物軟件及在線服務(wù)器對(duì)ZFP的理化性質(zhì)，各級(jí)結(jié)構(gòu)的特征進(jìn)行了分析，并利用生物信息學(xué)手段對(duì)獲得的ZFP進(jìn)行分析及優(yōu)化。 3.檢測(cè)ZFP在原核及真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及與A20基因假定啟動(dòng)子靶序列的結(jié)合活性： 全基因合成ZFP核酸序列，并構(gòu)建到不同的表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)染大腸桿菌及COS7細(xì)胞，分別利用RT-PCR、SDS-PAGE、WesternBlot、EMSA等手段觀察ZFP的表達(dá)情況及生物學(xué)活

11、性。結(jié)果顯示ZFP可分別在大腸桿菌及COS7內(nèi)有效表達(dá)并具有相應(yīng)的生物學(xué)活性。 4.人工轉(zhuǎn)錄因子ATF的構(gòu)建、表達(dá)及活性分析： ATF結(jié)構(gòu)包括：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(人工鋅指蛋白ZFP)、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(NF-κB亞基P65蛋白的激活域)、核定位信號(hào)(Nuclearlocalizationsignal，NLS)以及FlagFag。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ATF表達(dá)質(zhì)粒到ECV304細(xì)胞，分別應(yīng)用免疫細(xì)胞學(xué)方法、RT-PCR、WesternBl

12、ot、熒光素酶活性分析及EMSA檢測(cè)ATF融合蛋白的表達(dá)及生物學(xué)活性。結(jié)果顯示ATF在ECV304細(xì)胞中可正常表達(dá)，并且在NLS引導(dǎo)下能夠完成入核過(guò)程；EMSA結(jié)果顯示，ATF能夠特異性結(jié)合目標(biāo)靶序列；熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)顯示，ATF可有效啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。 5.ATF人工轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)A20基因的表達(dá)及抑制細(xì)胞凋亡的作用： ATF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞，觀察ATF啟動(dòng)A20基因的表達(dá)情況。并觀測(cè)在內(nèi)毒素刺激條件下，A

13、TF對(duì)ECV304細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果顯示ATF可啟動(dòng)內(nèi)源性A20表達(dá)，對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。 結(jié)論： 使用生物信息學(xué)手段分析了A20基因上游序列，確定了A20基因的TSS及假定啟動(dòng)子位置。A20基因的TSS位于人基因組NC_000006138230088處，其假定啟動(dòng)子位于人基因組NC_000006138229786-138230182。采用巢式PCR方法從人基因組中成功克隆了這一序列。 通

14、過(guò)雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析，證明克隆的假定啟動(dòng)子序列具有啟動(dòng)子生物學(xué)活性。 利用ZFtools服務(wù)器，獲得了人工鋅指蛋白ZFP的蛋白序列。通過(guò)生物信息學(xué)方法優(yōu)化獲得了ZFP核酸序列。 把全基因合成的ZFP序列分別亞克隆到不同載體上，構(gòu)建了重組原核及真核表達(dá)載體并成功表達(dá)。結(jié)果顯示利用生物信息學(xué)手段設(shè)計(jì)的人工鋅指蛋白可在原核及真核細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，并具有相應(yīng)的生物學(xué)活性。 以ZFP為DNA結(jié)合域、P65蛋白的激活區(qū)為效