瘢痕疙瘩成纖維細胞核轉(zhuǎn)錄因子-kB信號通路及其與鋅指蛋白A20相關(guān)性研究.pdf

1、瘢痕疙瘩(Keloid)是整形外科的常見疾病之一，是人類皮膚受損、創(chuàng)面愈合后局部組織過度纖維化的結(jié)果，常在易感人群中因外傷后發(fā)生，如外科手術(shù)、耳垂穿孔、注射、昆蟲叮咬和燒傷等，臨床上皮損超過原損傷界限，向周圍正常皮膚生長，呈瘤樣增生，故有“蟹足腫”之稱，其好發(fā)于前胸部、肩三角區(qū)、耳部和會陰部。不僅影響人體美觀，而且有不同程度的瘙癢或疼痛、甚至造成功能障礙，給患者帶來極大的心理和生理負擔，生活質(zhì)量受到嚴重的影響。臨床上局部應(yīng)用藥物治療可暫

2、時緩解癥狀，采用外科手術(shù)切除后，若不綜合抗瘢痕治療，極易復發(fā)，且向周圍組織外延性生長，因此，瘢痕疙瘩一直是整形外科領(lǐng)域研究的重點之一。
　　 目前，瘢痕疙瘩的病因?qū)W研究涉及各種因素，包括細胞因子、生長因子的過表達，基質(zhì)金屬蛋白酶降解的失衡，細胞凋亡的抑制等。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)其確切的形成原因，其組織學表現(xiàn)為組織過度纖維化、成纖維細胞(fibroblast，F(xiàn)b)的過度增殖及合成引起細胞外基質(zhì)(extracellular matr

3、ix，ECM)的大量沉積。諸多研究結(jié)果表明，成纖維細胞是瘢痕疙瘩發(fā)生的始動細胞，瘢痕疙瘩中成纖維細胞在基因表達、增殖凋亡、合成分泌、膠原代謝等方面均發(fā)生了改變，這些改變導致瘢痕疙瘩中的成纖維細胞執(zhí)行有別于正常成纖維細胞的生物學功能。但是，其發(fā)生促纖維化作用的具體細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路機理尚不十分清楚。
　　 核因子—κB(Nuclear faotor KB，NF—κB)是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，對細胞內(nèi)許多基因的表達起著關(guān)

4、鍵性的調(diào)控作用。其信號傳導通路貫穿于創(chuàng)傷修復與愈合的整個生物學過程，它是信號從細胞表面轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)部的重要傳遞者，參與細胞的生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能，并在細胞纖維化過程中起重要作用；核轉(zhuǎn)錄因子—κB是由兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)，以p50/p65異源二聚體最多見。主要介導Rel蛋白與DNA的結(jié)合，當細胞處于靜息狀態(tài)時，NF—κB的p65亞基被抑制蛋白IrBs滯留在細胞質(zhì)中，不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。NF—κB在外來信號刺激下

5、，其抑制性蛋白IkB降解，NF—κB從中解離，進入細胞核，與細胞核內(nèi)特定的DNA序列結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　 鋅指蛋白A20(zinc finger protein A20)是一種能負性調(diào)控核因子—κB(NF—κB)表達的基因調(diào)控蛋白，其在抑制NF—κB信號途徑介導的細胞凋亡中具有重要的作用。目前，關(guān)于NF—κB信號轉(zhuǎn)導通路在瘢痕疙瘩中研究甚少，鋅指蛋白A20的表達變化及其與NF—κB的相互關(guān)系在瘢痕疙瘩中尚無研究。

6、>　　 本實驗擬以正常皮膚和瘢痕疙瘩為研究對象，通過采用免疫組織化學染色、體外培養(yǎng)成纖維細胞、提取成纖維細胞總RNA、采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(yīng)(RT—PCR)等多種技術(shù)，對鋅指蛋白A20、核轉(zhuǎn)錄因子—κB在瘢痕疙瘩、正常皮膚以及正常皮膚成纖維細胞和瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達變化進行研究，探討核轉(zhuǎn)錄因子—κB信號通路、鋅指蛋白A20對瘢痕疙瘩形成是否具有作用以及其對成纖維細胞增殖、凋亡的作用。將為深入研究瘢痕疙瘩的形成機制、完

7、善調(diào)控瘢痕疙瘩的信號轉(zhuǎn)導通路、為預防瘢痕疙瘩的形成和尋找可能作用的治療靶點提供理論依據(jù)。
　　 研究目的
　　 1．檢測鋅指蛋白A20和NF—κB在正常皮膚組織及瘢痕疙瘩組織中的表達。
　　 2．了解體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長增殖與體外培養(yǎng)正常皮膚來源的成纖維細胞的差異，以及二者進入對數(shù)生長期的時間。3．檢測鋅指蛋白A20和NF—κB在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中mRNA的表達。

8、　　 4．了解核轉(zhuǎn)錄因子—κB信號通路的激活情況及其與瘢痕疙瘩形成的相互關(guān)系，為探索新的預防和治療瘢痕疙瘩的方法提供思路。
　　 材料
　　 瘢痕疙瘩標本共16例，其中男性6例，女性10例，年齡18～42歲，平均32．60±0．38歲，取材部位包括耳垂、前胸等部位，病程為6個月～10年，平均3．40±0．60年。外觀發(fā)紅充血、質(zhì)硬、高出皮膚表面，局部伴瘙癢或疼痛等不適，無感染和潰瘍，未曾應(yīng)用抗瘢痕藥物、彈力加壓、放療等

9、方法治療。正常皮膚16例，男9例，女7例，年齡2～54歲，平均年齡23．54±0．42歲。取材部位為上臂內(nèi)側(cè)、腹部全厚植皮術(shù)修剪后剩余皮片。各標本均有詳細的完整病歷和隨訪記錄，所取標本之患者無合并皮膚疾病、結(jié)締組織病和其它重要臟器疾??；術(shù)前均未行放療、激光治療及免疫治療；所有標本均經(jīng)病理證實。
　　 方法
　　 1取人正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織標本，制作石蠟切片，應(yīng)用免疫細胞化學染色技術(shù)檢測鋅指蛋白A20和NF—κB的表

10、達，觀察其在正常皮膚及瘢痕疙瘩中表達的差異。
　　 2應(yīng)用組織微粒貼壁法，體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞，繪制二者生長曲線，通過細胞計數(shù)法對體外培養(yǎng)的正常皮膚和瘢痕疙瘩組織成纖維細胞生長曲線測定比較，了解瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長增殖與正常皮膚來源的成纖維細胞的差異，觀察二者進入對數(shù)生長期的時間是否相同。
　　 3以瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞為研究對象，將第4代成纖維細胞用于實驗，應(yīng)用實時熒光定

11、量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reversetranscription—polymerase chain reaction，RT—PCR)技術(shù)檢測NF—κB和鋅指蛋白A20mRNA的表達，以明確其在體外培養(yǎng)的成纖維細胞中各自的表達特征。
　　 結(jié)果
　　 1人正常皮膚組織中和瘢痕疙瘩組織中NF—κB pp65的表達
　　 免疫組織化學染色結(jié)果表明，NF—κB p65定位于成纖維細胞胞漿和胞核，正常情況下呈棕黃色顆粒，胞

12、核幾乎無染色；活化后進入核內(nèi)，表現(xiàn)為核染色；NF—κB p65在瘢痕疙瘩中的大部分成纖維細胞胞核陽性表達，陽性表達率為87．50％(14/16)；在人正常皮膚中的大部分成纖維細胞胞核呈陰性表達，陽性表達率為6．25％(1/16)。二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。
　　 2人正常皮膚組織中和瘢痕疙瘩組織中鋅指蛋白A20的表達
　　 免疫組織化學染色結(jié)果表明，鋅指蛋白A20染色陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細胞漿

13、內(nèi)。鋅指蛋白A20在瘢痕疙瘩成纖維細胞胞漿中呈弱陽性表達，陽性表達率為18．75％(3/16)；鋅指蛋白A20在人正常皮膚成纖維細胞胞漿呈陽性表達中，陽性表達率為87．50％(14/16)。二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。
　　 3體外培養(yǎng)的正常皮膚成纖維細胞和瘢痕疙瘩組織成纖維細胞生長曲線比較
　　 瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長增殖與正常皮膚來源的成纖維細胞無明顯差異，二者進入對數(shù)生長期的時間大致相同。

14、>　　 4體外培養(yǎng)的成纖維細胞凍存后的復蘇情況
　　 體外培養(yǎng)的成纖維細胞在液氮中凍存后，細胞復蘇狀態(tài)良好，接種后絕大部分細胞存活，生長旺盛，存活率達85％，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與凍存前無明顯差異。
　　 5人正常皮膚成纖維細胞中和瘢痕疙瘩成纖維細胞中NF—κB mRNA的表達
　　 通過實時熒光定量RT—PCR顯示：NF—κB mRNA在正常皮膚成纖維細胞中的表達量減少，在瘢痕疙瘩成纖維細胞中NF—

15、κB mRNA的表達量顯著增加，二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。
　　 6人正常皮膚成纖維細胞中和瘢痕疙瘩成纖維細胞中鋅指蛋白A20 mRNA的表達
　　 通過實時熒光定量RT—PCR顯示：鋅指蛋白A20 mRNA在正常皮膚成纖維細胞和瘢痕疙瘩的成纖維細胞中均有表達，在正常皮膚成纖維細胞中A20 mRNA的表達量多于瘢痕疙瘩成纖維細胞中A20 mRNA表達量，二者比較，差別具有顯著性意義(P<0．05)。<

16、br>　　 結(jié)論
　　 1 NF—κB在瘢痕疙瘩組織中的高表達，說明其信號通路異?？赡軈⑴c瘢痕疙瘩的形成，并介導瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。
　　 2 A20在瘢痕疙瘩中的低表達，說明瘢痕疙瘩形成機制可能與A20對核轉(zhuǎn)錄因子—κB的抑制減弱有關(guān)。
　　 3正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞的生長增殖無明顯差異，二者進入對數(shù)生長期的時間大致相同。
　　 4瘢痕疙瘩來源的成纖維細胞及正常皮膚來源的成纖維細