基于靶點Osx的人工轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計及miRNA篩選與功能研究.pdf

1、一、研究背景：
　　骨骼的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)依賴于骨形成與骨吸收兩個過程，其中骨吸收由單核細(xì)胞來源的破骨細(xì)胞來介導(dǎo)，未分化間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC)來源的成骨細(xì)胞則在骨骼發(fā)育及骨的形成過程中起著重要作用。在成骨細(xì)胞分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子Runx2/Cbfa1、Osterix（Osx，也稱為Sp7）及ATF4高表達或特異性表達于成骨細(xì)胞并調(diào)控成骨標(biāo)志物的表達，這些成骨標(biāo)志物包括堿性磷酸酶(Alp)及骨鈣

2、素(Ocn)等。Runx2或Osx基因敲除小鼠不能形成成熟的成骨細(xì)胞及骨，因此Runx2與Osx被公認(rèn)為成骨分化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Runx2主要表達于肥大前期軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，在軟骨生成與骨生成中起著多種作用。Osx，又稱為sp7，是含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達于軟骨下骨和膜內(nèi)骨的成骨細(xì)胞，處于Runx2/Cbfa1的下游，在成骨細(xì)胞分化及小鼠胚胎期、出生后及成年期的骨形成過程中起著必不可少的作用。
　　肝素結(jié)

3、合表皮生長因子（Heparin-binding epidermal growth factor, HBEGF）屬于表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)家族的成員之一，能夠以高親和力與表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合激活EGFR信號通路，包括細(xì)胞外信號相關(guān)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ER

4、K)、JNK及磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/Akt。EGFR信號通路參與許多生理學(xué)及病理學(xué)過程，包括成骨分化及骨的形成。EGFR缺失時，成骨細(xì)胞增殖分化異常、骨形成及骨結(jié)構(gòu)受損。而且，HBEGF-EGFR信號通路能夠抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、MC3T3-E1細(xì)胞及C2C12細(xì)胞向成骨方向分化。
　　二、研究方法：
　　1.基于Osx為靶點的人工轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計:通過文獻檢索

5、的方式查詢Osx的啟動子序列;將此序列輸入到人工轉(zhuǎn)錄因子在線設(shè)計軟件Zinc Finger Tools（http:www.zincfingertools.org），通過高得分、無位點重疊、高特異性及與轉(zhuǎn)錄起始位點的距離等條件選取三個最佳的鋅指蛋白（DNA結(jié)合域）;將鋅指蛋白氨基酸序列譯成核苷酸序列后，與功能域VP64、核定位信號(NLS)以及標(biāo)簽HA及酶切位點核苷酸序列組合并優(yōu)化后，便得到人工轉(zhuǎn)錄因子的完整核苷酸序列。
　　2.人

6、工轉(zhuǎn)錄因子表達載體的構(gòu)建及表達:對人工轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列進行全基因合成并構(gòu)建到pcDNA3.1(pCMV-empty)載體中，形成人工轉(zhuǎn)錄因子表達載體pCMV-ZFP-VP64。Western blot法檢測該表達載體轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞后人工轉(zhuǎn)錄因子ZFP-VP64的表達情況。
　　3.人工轉(zhuǎn)錄因子激活Osx啟動子能力及與Osx啟動子結(jié)合特異性分析:將表達載體pCMV-ZFP-VP64與Osx啟動子報告載體共轉(zhuǎn)染到MC3T

7、3-E1細(xì)胞中，通過雙熒光素酶報告分析驗證人工轉(zhuǎn)錄因子ZFP-VP64激活Osx啟動子的能力，并依此選取三個轉(zhuǎn)錄因子中活性最強的一個。然后通過雙熒光素酶報告分析、電泳遷移率分析(EMSA)及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等方法檢測該轉(zhuǎn)錄因子與Osx啟動子結(jié)合的特異性。
　　三、研究結(jié)果：
　　1.基于Osx為靶點的人工轉(zhuǎn)錄因子的設(shè)計:將Osx啟動子序列輸入到在線軟件Zinc Finger Tools后，按高得分、無位點重疊、高

8、特異性及與轉(zhuǎn)錄起始位點的距離等條件于Osx啟動子序列中篩選到3個鋅指蛋白結(jié)合位點（-94/-77、-387/-370及-841/-824），與之相對應(yīng)的人工鋅指蛋白分別為ZFP1、ZFP2及ZFP3，鋅指蛋白與功能域VP64、核定位信號NLS及檢測標(biāo)簽HA結(jié)合后分別形成人工轉(zhuǎn)錄因子ZFP1-VP64、ZFP2-VP64及ZFP3-VP64。
　　2.人工轉(zhuǎn)錄因子激活Osx啟動子能力及與Osx啟動子結(jié)合特異性分析:人工轉(zhuǎn)錄因子表達載

9、體pCMV-ZFP1-VP64、pCMV-ZFP2-VP64或pCMV-ZFP3-VP64與Osx啟動子報告載體pGL3-OsxP共轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞后，雙熒光素酶報告分析結(jié)果顯示，ZFP1-VP64、ZFP2-VP64及ZFP3-VP64均能使熒光素酶活性顯著提高，其中ZFP2-VP64作用最為明顯，能夠使熒光素酶活性提高至空白對照組的約6.9倍。并且，隨著pCMV-ZFP2-VP64轉(zhuǎn)染劑量的增加，熒光素酶的活性也相應(yīng)增加，這

10、表明ZFP2-VP64能夠特異性激活Osx啟動子。EMSA結(jié)果顯示，標(biāo)記探針（生物素標(biāo)記的ZFP2結(jié)合寡核苷酸序列）能夠探測到ZFP2-VP64-DNA復(fù)合體，而變異探針則不能探測到該復(fù)合體的存在。而且，隨著冷探針劑量的增加，該復(fù)合體條帶信號逐漸變?nèi)?，這表明ZFP2-VP64能與Osx啟動子-387/-370位點特異性結(jié)合。為進一步驗證兩者結(jié)合的特異性，我們設(shè)計了一對可以擴增Osx啟動子-465/-270片段（包含-387/-370位點

11、）的引物并實施了ChIP實驗。結(jié)果表明，當(dāng)HA抗體存在時，能夠出現(xiàn)預(yù)期PCR條帶(196bp)。而對照抗體IgG存在時，則不能擴增出該條帶，這進一步表明ZFP2-VP64與Osx啟動子結(jié)合的特異性。
　　3.ZFP2-VP64上調(diào)Osx的表達并促進成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞的分化:將不同劑量pCMV-ZFP2-VP64載體轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞后，real-time PCR結(jié)果顯示OsxmRNA水平呈現(xiàn)劑量依賴性增加，Wes

12、tern blot結(jié)果顯示Osx蛋白也呈現(xiàn)劑量依賴性增加，而對照組則未出現(xiàn)顯著的Osx表達變化。這表明，通過Zinc Finger Tools設(shè)計的Osx啟動子特異性人工轉(zhuǎn)錄因子ZFP2-VP64能夠有效激活MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)sx的表達。而且，Western結(jié)果表明，ZFP2-VP64能夠促進Osx下游蛋白ATF4的表達，而Osx上游蛋白Runx2的表達則未出現(xiàn)明顯變化。眾所周知，Osx表達上調(diào)能夠促進成骨細(xì)胞的分化，因此，我

13、們進一步驗證了ZFP2-VP64對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。將pCMV-ZFP2-VP64載體轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞并成骨誘導(dǎo)3天及7天后，Alp及Ocn mRNA水平較對照組明顯上調(diào);成骨誘導(dǎo)7天后， MC3T3-E1細(xì)胞Alp染色明顯增強;成骨誘導(dǎo)21后，Alizarin Red染色也明顯增強。這些結(jié)果表明，ZFP2-VP64能夠上調(diào)Osx的表達并促進成骨細(xì)胞的分化。
　　四、結(jié)論：
　　1.本研究通過在線

14、設(shè)計軟件Zinc Finger Tools設(shè)計了以O(shè)sx啟動子為靶點的人工轉(zhuǎn)錄因子ZFP2-VP64。ZFP2-VP64能夠特異性結(jié)合到Osx啟動子的-387/-370位點，并能顯著激活Osx基因的轉(zhuǎn)錄。ZFP2-VP64導(dǎo)致的Osx表達上調(diào)能夠促進成骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并能減少卵巢摘除術(shù)小鼠股骨局部骨量丟失。這些結(jié)果表明，ZFP2-VP64具有進一步開發(fā)為治療骨質(zhì)疏松藥物的可能性，值得進一步研究。
　　2.本研究