鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZNF580相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、背景：ZNF580基因是本課題組以致動脈粥樣硬化因素-低密度脂蛋白誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，采用差異顯示逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)分析得到的一個新基因(Genbank注冊號：AF184939)。其cDNA748-1266位堿基序列構(gòu)成一個完整的開放閱讀框架，編碼172個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。其氨基端5-88位氨基酸序列為脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨基酸序列中含有三個串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。ZNF580蛋白的結(jié)構(gòu)與Sp

2、1/KLF鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員非常相似，Sp1/KLF家族成員的羧基端氨基酸序列中均含有三個高度保守的C2H2型鋅指蛋白主構(gòu)域，氨基端一般不具保守性。故ZNF580很可能是Sp1/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個新成員。最新的研究顯示：Sp1/KLF家族成員可能是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制的最重要參與者。具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、個體生長發(fā)育等諸多功能并可能參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。Sp1/KLF家族成員調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制主要是其鋅指結(jié)構(gòu)可以作為DNA結(jié)

3、合域(DNA binding domain，DBD)，與靶基因富含G/C的順式作用元件結(jié)合，識別靶基因調(diào)控區(qū)9個核苷酸組成的順式作用元件。但越來越多的證據(jù)顯示：鋅指轉(zhuǎn)錄因子既可結(jié)合DNA，又可結(jié)合蛋白質(zhì)。且在結(jié)合蛋白質(zhì)方面，具有更加重要而廣泛的作用。
　　 目的：尋找可能與鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZNF580存在相互作用的蛋白，并深入研究ZNF580的功能及其可能參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并最終揭示其與血管內(nèi)皮損傷及動脈粥樣硬化性疾病發(fā)生間的關(guān)系

4、。
　　 方法：以ZNF580基因開放閱讀框作為模版，PCR擴(kuò)增后連接入酵母表達(dá)質(zhì)粒pGB。誘餌質(zhì)粒pGB-ZNF580經(jīng)測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化酵母菌株Y190，人胎腦cDNA文庫亦轉(zhuǎn)化到能穩(wěn)定表達(dá)誘餌蛋白的Y190酵母菌株中，并鋪到含有營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培養(yǎng)皿上進(jìn)行初步篩選。所得陽性克隆再進(jìn)行β-gal濾紙轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步去除假陽性后共獲得136個陽性克隆。隨機(jī)挑取其中40個，逐一轉(zhuǎn)化入含有誘餌質(zhì)

5、粒的Y190酵母菌進(jìn)行一對一驗(yàn)證，最終確定其中的35個為陽性克隆，分離陽性克隆質(zhì)粒并測序。最后應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析陽性克隆cDNA編碼的蛋白。在14種蛋白中，我們重點(diǎn)選擇SMAD2進(jìn)行進(jìn)一步的研究，因?yàn)镾MAD2是哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要信號分子。我們在人胚腎293(human embryonickidney，HEK293)細(xì)胞中用免疫共沉

6、淀的方法驗(yàn)證了ZNF580和SMAD2的相互作用。又進(jìn)一步在EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中應(yīng)用免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)檢測了兩種蛋白在細(xì)胞中的定位。
　　 結(jié)果：確定了14種與ZNF580可能存在相互作用的蛋白。分別為：Activity-dependent neuroprotective protein(ADNP)、Smad family member2(SMAD2)、Glyoxalase domain containing4(GLOD4

7、)、Kinesin family member3A(KIF3A)、Kinesin-associated protein3(KIFAP3)、Phospholipase A2-activatingprotein(PLAA)、Phospholipase C gamma1(PLCG1)、XPA binding protein2(XAB2)、Tripartite motif-containing32(TRIM32)、Suppressor of T

8、y16 homolog(SUPT16H)、Wilms tumor1 interacting protein(WTIP)、DIP2 disco-interactingprotein2 homolog C(DIP2C)、SH3-domain GRB2-like3(SH3GL3)、D4，zinc anddouble PHD fingers family1(DPF1)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZNF580和SMAD2在HEK293細(xì)胞中存在相互作用。

9、免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩種蛋白在EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象，且定位主要集中于細(xì)胞核。
　　 結(jié)論：
　　 1.獲得了14種與ZNF580可能存在相互作用的候選蛋白。
　　 2.免疫共沉淀及免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZNF580和SMAD2在哺乳動物細(xì)胞中存在相互作用，且此種相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞核中。
　　 3.ZNF580是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游分子，其在細(xì)胞核中可以和SMAD2形成共作