鹽爪爪和鹽穗木的耐鹽生理生化及耐鹽相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、本文從生理和分子角度對(duì)其耐鹽性進(jìn)行了初步的探討，開展這兩種鹽生植物耐鹽相關(guān)基因的克隆及鹽爪爪液泡膜上多個(gè)耐鹽相關(guān)基因的遺傳工程，為作物和林木的遺傳改良奠定堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 首先，對(duì)鹽爪爪和鹽穗木在種子萌發(fā)階段的耐鹽性進(jìn)行了比較研究，表明鹽爪爪和鹽穗木都是很耐鹽的鹽生植物，在種子萌發(fā)期，鹽穗木比鹽爪爪更耐鹽；NaCI和等滲的聚乙二醇(PEG)對(duì)種子的萌發(fā)都產(chǎn)生抑制作用，且PEG的抑制程度大于等滲的NaCI。在總體水平上都降低

2、了種子的萌發(fā)率，推遲了種子的初始萌發(fā)時(shí)間和延長(zhǎng)了種子的萌發(fā)時(shí)間；低濃度的NaCl．溶液對(duì)種子萌發(fā)的幼苗生長(zhǎng)起著促進(jìn)作用。在100 mmol·L<'-1>NaCl．處理時(shí)，兩種鹽生植物幼苗的胚根和幼芽長(zhǎng)度都達(dá)到最大值，幼苗的生長(zhǎng)狀況也最好。對(duì)鹽爪爪和鹽穗木在鹽脅迫下的耐鹽生理生化做了檢測(cè)，包括Na<'+>，k<'+>，Ca<'2+>含量的測(cè)定，植物葉、脯氨酸和水勢(shì)的變化，丙二醛和超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的分析。結(jié)

3、果為Na<'+>和脯氨酸都是有效的滲透調(diào)節(jié)劑，處于低水勢(shì)的植物細(xì)胞仍舊能從細(xì)胞外高濃度的鹽溶液中吸收水分。而且作者認(rèn)為對(duì)于一些很耐鹽的鹽生植物，長(zhǎng)期的進(jìn)化使其該類植物適應(yīng)并需要鹽的環(huán)境才能生長(zhǎng)得更好。實(shí)驗(yàn)證明鹽爪爪和鹽穗木的生長(zhǎng)是需鹽的，這兩種鹽生植物在相對(duì)低的鹽度環(huán)境中生長(zhǎng)是合適的環(huán)境，而在沒有鹽和高濃度的鹽環(huán)境中生長(zhǎng)是逆境。采用同源序列法和race技術(shù)克隆了鹽爪爪和鹽穗木鹽相關(guān)的3類基因的讀碼框，極大地豐富了植物的耐鹽基因資源。分別

4、為(1)獲得了鹽爪爪和鹽穗木液泡膜焦磷酸酶(H<'+>-pyrophosphatase)基因，分別命名為KfVPJ和hc VPl，讀碼框序列長(zhǎng)度都為2295bp，編碼764個(gè)氨基酸，GenBank登陸號(hào)分別為EF114315和EF471358；(2)獲得了鹽爪爪和鹽穗木液泡膜ATPase B亞基(VHA-B)基因，分別命名為kIVHA-B和HcVHA-B，讀碼框的序列長(zhǎng)度都為1467bp，編碼488個(gè)氨基酸，GenBank登陸號(hào)分別為E

5、FI-14316和EF471357；(3)獲得了鹽爪爪和鹽穗木催化合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甜菜堿的甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因，分別命名為KfBADH和HcBADH,讀碼框序列長(zhǎng)度都為1503bp，編碼500個(gè)氨基酸殘基，GenBank登陸號(hào)分別為DQ923617和EF471356。 利用半定量RT-PCR的方法初步獲得了鹽爪爪液泡膜上耐鹽相關(guān)基因KfVP1，KfVHA-B和．KfNHX1及甜菜堿醛脫氫酶KfBADH和脯氨酸合成關(guān)鍵酶

6、P5CS基因在鹽(0，100，300，500，700 mmol·L<'-1>)脅迫4d條件下各基因在mRNA水平上的表達(dá)情況。檢測(cè)的各基因均受鹽的誘導(dǎo)。P5CS和KfBADH基因的表達(dá)隨著鹽濃度的升高而表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而脯氨酸的含量也隨著鹽脅迫程度的增強(qiáng)而在鹽爪爪肉質(zhì)化葉內(nèi)積累更多，說明脯氨酸和甜菜堿作為重要的滲調(diào)物質(zhì)，在植物逆境脅迫中可能發(fā)揮著重要的作用。沒有經(jīng)過NaCl處理的鹽爪爪，其肉質(zhì)葉中液泡膜上的3個(gè)基因NHX1，VHA-B和V

7、P1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)受到明顯抑制或者表達(dá)不強(qiáng)，而經(jīng)不同濃度NaCI．處理的鹽爪爪植株葉，其各基因的表達(dá)表現(xiàn)差異。KfNHX1基因在受到300 mmol·L<'-1>NaCl處理時(shí)表達(dá)達(dá)到最強(qiáng)： KfVP1基因在100 mmol·L<1>NaCl處理時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，隨著鹽濃度的提高表達(dá)依次減弱；KfVHA-B基因在0和100 mmol·L<'-1>NaCl處理時(shí)，表達(dá)差異不明顯，而在300，500和700 mmol·L<'-1>

8、 NaCI處理時(shí)表達(dá)能持續(xù)增強(qiáng)，由此推測(cè)鹽爪爪液泡膜上H<'+>-PPase酶和H<'+>-ATP酶這兩種酶在不同濃度的鹽脅迫下可以持續(xù)供能。構(gòu)建了鹽爪爪KfVP1和KfNHX1基因與GFP(綠色熒光蛋白基因)的融合植物表達(dá)載體，分別為pCAMBIAl301-1-KfdtVP1-GYP,pCAMBIA1301-1-1-KfdtNHX1-GFP,通過基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，利用熒光倒置顯微鏡觀察鹽爪爪這兩個(gè)基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)部

9、位。結(jié)果表明鹽爪爪KfVP1和KfNHX1可能定位在液泡膜上，至少在膜系統(tǒng)上。 構(gòu)建了鹽爪爪液泡膜上離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因KfVP1和KfNHX1的植物表達(dá)載體，分別為pCAMBIA1301-1-KfVP1，pCAMBIA1301-1-KfNHX1和pBin438一KfNHX1 3種植物表達(dá)載體，獲得了KfVP1和KfNHX1當(dāng)代煙草轉(zhuǎn)基因植株和用400 mmol·L<'-1>NaCl脅迫煙草的耐鹽表型和衡量葉細(xì)胞膜受損的相對(duì)電導(dǎo)