MERS冠狀病毒3C樣蛋白酶生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景：中東呼吸道綜合征冠狀病毒（Middle East Respiratory Syndrome，MERS-CoV）是人類新發(fā)冠狀病毒，首次被Zaki小組從沙特阿拉伯一名患有呼吸道感染和腎功能衰竭的老年患者體內(nèi)分離出來，并于2012年9月確診。目前中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS）造成1952人感染，其中693例死亡，死亡率高達(dá)36%，對(duì)人類生命和健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。MERS復(fù)制酶聚合體（Replicase complex，RC）的形成主

2、要取決于木瓜樣蛋白酶（Papain-like protease，PLpro）和3C樣蛋白酶（3C-like protease，3CLpro），抑制這兩種蛋白酶的激活可有效阻斷病毒復(fù)制。冠狀病毒木瓜樣蛋白酶在宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起重要作用，這是前期實(shí)驗(yàn)室研究的結(jié)果，但目前對(duì)冠狀病毒3CLpro研究較少，其與抗病毒天然免疫反應(yīng)的關(guān)系還不清楚。本課題將主要研究MERS3C樣蛋白酶，深入研究其與宿主抗病毒天然免疫關(guān)系等生物學(xué)功能。

3、r>　　目的：從MERS3CLpro調(diào)控細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)機(jī)制及其在宿主細(xì)胞中是否誘導(dǎo)自噬進(jìn)行研究，為探究人類新發(fā)MERS冠狀病毒參與免疫反應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：首先，合成MERS-CoV/SARS-CoV/NL63-CoV3CLpro，利用PCR定點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建蛋白酶活性缺失突變體。其次，利用蛋白印跡法?雙熒光素酶活性測定法?酶聯(lián)免疫吸附法和實(shí)時(shí)定量PCR等研究技術(shù)，檢測MERS3CLpro及突變體對(duì)干擾素水平以及泛素

4、化蛋白的影響；利用免疫共沉淀技術(shù)研究3CLpro與RIG-I通路關(guān)鍵因子泛素化水平影響。為了研究冠狀病毒3C樣蛋白酶與細(xì)胞自噬的關(guān)系，將帶有綠色熒光蛋白GFP基因的LC3B與MERS3CLpro轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，通過細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)確定MERS3CLpro是否引起特征性GFP-LC3B點(diǎn)狀聚集。其次，利用Western blotting和電鏡技術(shù)檢測3CLpro誘導(dǎo)自噬效應(yīng)。為了探究自噬體產(chǎn)生機(jī)制，首先Western blotting技

5、術(shù)檢測自噬蛋白p62的表達(dá)情況；隨后使用免疫熒光技術(shù)檢測由3CLpro誘導(dǎo)的pmRFP-GFP-LC3綠色和紅色點(diǎn)狀熒光聚集。
　　結(jié)果：1.3CLpro是由人冠狀病毒編碼的新IFN拮抗蛋白：（1）通過雙熒光素酶活性檢測技術(shù)對(duì)3CLpro調(diào)控干擾素活性分析，發(fā)現(xiàn)MERS/SARS/NL633CLpro均可抑制RIG-IN介導(dǎo)以及仙臺(tái)病毒刺激下細(xì)胞內(nèi)干擾素激活活性，酶聯(lián)免疫吸附測定和實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)3CLpro抑制細(xì)

6、胞內(nèi)干擾素表達(dá)。同時(shí)檢測3CLpro對(duì)關(guān)鍵蛋白介導(dǎo)的IFN信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示3CLpro明顯抑制IPS-1/ERIS/TBK1/IRF3/IRF7激活的干擾素產(chǎn)生;（2）對(duì)3CLpro干擾素拮抗活性的特異性研究發(fā)現(xiàn)，3CLpro兩種蛋白酶活性突變體不抑制IFN表達(dá)，提示3CLpro抑制干擾素活性依賴于其催化活性位點(diǎn)。
　　2. MERS3CLpro是一種新DUB酶：（1）將MERS3CLpro分別與泛素分子HA-Ub，以及H

7、A-Ub K48，HA-Ub K63基因轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MERS3CLpro能有效地去除細(xì)胞內(nèi)蛋白的泛素化修飾，證實(shí)MERS3CLpro具有細(xì)胞內(nèi)去泛素化（DUB）活性，且3CLpro的DUB活性與其蛋白酶催化活性密切相關(guān)。使用表達(dá)純化的3CLpro進(jìn)行體外DUB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這一特性。（2）以類泛素分子（SUMO和ISG15）為作用底物，發(fā)現(xiàn)3CLpro具有去SUMO活性和去ISG活性，且其活性依賴于酶催化活性位點(diǎn)。<

8、br>　　3. MERS3CLpro抑制IFN機(jī)制研究：利用免疫共沉淀技術(shù)檢測，表明3CLpro通過抑制或減弱RIG-I／TBK1／IRF3等蛋白泛素化從而負(fù)調(diào)控干擾素表達(dá)，且其活性依賴于3CLpro酶催化活性位點(diǎn)。
　　4. MERS3CLpro是新發(fā)現(xiàn)的自噬誘導(dǎo)蛋白：（1） MERS3CLpro誘導(dǎo)eGFP-LC3B綠色熒光點(diǎn)狀積累，MERS3CLpro誘導(dǎo)自噬微管蛋白1-輕鏈3（LC3-II）表達(dá)上調(diào)說明3CLpro可誘導(dǎo)自

9、噬。電子投射電鏡技術(shù)證實(shí)，3CLpro誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)自噬體特征性雙層膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)3CLpro可激活自噬。（2）研究發(fā)現(xiàn)3CLpro誘導(dǎo)不完全自噬作用，MERS3CLpro誘導(dǎo)自噬具有依賴時(shí)間性且獨(dú)立于其酶催化活性。（3）研究發(fā)現(xiàn)其它兩種感染人的冠狀病毒3CLpro如SARS和NL63等均誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，提示3CLpro誘導(dǎo)細(xì)胞自噬特性廣泛存在于人類冠狀病毒中。
　　結(jié)論：本課題研究發(fā)現(xiàn)了3CLpro調(diào)控宿主免疫反應(yīng)及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬