EV71 3C蛋白酶及其與抗病毒藥物相互作用的結構生物學研究.pdf

1、人腸道病毒71型(human enterovirus 71，EV71)是1969年首次從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的。不同亞型感染后臨床癥狀不完全相同，通常導致手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)。重癥手足口病可導致無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關的疾病，致殘及病死率較高。自1974年首次報道以來，EV71已在世界范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行。

2、在我國，手足口病曾經(jīng)在南方許多省市發(fā)生過數(shù)次大規(guī)模流行，成為嚴重威脅人民健康的重大傳染病之一，目前尚無有效的藥物和疫苗。
　　我國研究人員病毒基因工程國家重點實驗室金奇教授等在1998年率先測定了EV71的基因全序列。EV71是小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。病毒基因組為約7500個核苷酸的單股正鏈RNA，基因組中儀有一個開放閱讀框，編碼約2200個氨基酸的無生物活性的EV71多聚蛋白前體(polyprotein)。該多聚蛋白需進

3、一步被剪切，產(chǎn)生成熟的病毒結構蛋白和非結構蛋白。這些過程主要依賴于EV713C蛋白酶。EV713C蛋白酶不但可以對病毒前體蛋白進行剪切，還可以降解宿主蛋白，如多聚腺嘌呤核苷酸修飾調(diào)控蛋白（cleavage stimulation factor-64，CstF-64），從而干擾宿主mRNA合成。最近的研究表明EV713C能夠通過結合視黃酸誘導基因-1(retinoid acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)受體從而干擾RI

4、G-Ⅰ類解旋酶引發(fā)的天然免疫應答。除了蛋白酶功能以外，EV713C還具有識別病毒基因組RNA5'-非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)的活性，暗示了EV713C可能參與病毒RNA基因組復制的過程?；贓V713C在病毒生命周期和病毒宿主相互作用過程中的重要功能，該蛋白被認為是抗病毒藥物設計的重要靶點之一。
　　由于EV713C蛋白酶尚無結構信息，極大地限制了結構導向性EV713C蛋白酶抑制劑的研究。本研究首

5、次解析了高分辨率(1.0(A))的EV713C蛋白及其與rupintrivir(AG7088，蘆平曲韋)形成復合物的晶體結構。結構分析表明，EV713C的基本結構與其它小RNA病毒3C蛋白酶相似，具有絲氨酸蛋白酶家族的典型折疊。我們發(fā)現(xiàn):EV713C蛋白酶的β折疊環(huán)維持了罕見的開放構象，而這一重要的結構元件在其他結構已知的3C蛋白酶中維持閉合構象。通過結構比對分析，我們發(fā)現(xiàn)了兩個位于β折疊環(huán)底部的保守氨基酸Gly123和His133，可

6、起到鉸鏈作用，從而控制β折疊環(huán)的構象變化。通過點突變實驗我們證明了兩個鉸鏈氨基酸肽鍵的靈活性在EV713C蛋白酶底物識別和底物水解中起到重要作用。Rupintrivir是通過模擬肽底物設計的一種抗人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)3C蛋白酶的抑制劑，最近研究證明它也能有效抑制一些腸道病毒。我們發(fā)現(xiàn)rupintrivir可以有效抑制EV71病毒(BJ/CHN/2008)復制，并在體外抑制EV713C的蛋白酶活性。為了闡明

7、rupintrivir抗EV71的分子機制，我們進行了EV713C蛋白酶/rupintrivir共結晶實驗獲得了高分辨率的復合物晶體結構。結構分析表明，rupintrivir不可逆的結合在EV713C蛋白酶底物識別口袋中，其結合模式大體類似于rupintrivir與HRV3C的相互作用。Rupintrivir的C端部分不能穩(wěn)定的結合在EV713C蛋白酶的離去集團口袋中。通過EV713C/rupintrivir復合物分子表面繪圖發(fā)現(xiàn)EV7

8、13C蛋白酶底物識別區(qū)中存在一個凹陷的S2'口袋。類似的結構特征不存在于HRV3C蛋白酶結構中，但是存在于柯薩奇病毒(coxsackievirus B，CVB)3C蛋白酶和脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)3C蛋白酶結構中。結合點突變實驗我們證明了Glu71對于保持具有催化活性的His40的有效性構象具有不可替代的作用，從而進一步支持這類蛋白酶具有催化三聯(lián)體的蛋白酶水解機制的假說。我們的實驗數(shù)據(jù)還揭示了一個以往沒有描述過的保守