基于磁珠分離和滾環(huán)擴(kuò)增電化學(xué)發(fā)光方法在基因點(diǎn)突變檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、腫瘤基因突變分析在各種遺傳相關(guān)疾病早期臨床診斷中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，而且還被應(yīng)用于抗藥性早期監(jiān)測(cè)。因?yàn)檫z傳相關(guān)疾病會(huì)存在大量的特異位點(diǎn)的基因突變，同一個(gè)體不同組織的基因突變位點(diǎn)也會(huì)有差異，因此發(fā)展一種高靈敏的，快速的，準(zhǔn)確同時(shí)簡(jiǎn)單的基因突變檢測(cè)的方法已成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)話題。
　　 基因點(diǎn)突變分析技術(shù)大概包括兩大部分：等位基因識(shí)別技術(shù)和等位基因檢測(cè)技術(shù)。引物延伸技術(shù)、等位特異性雜交技術(shù)、限制性?xún)?nèi)切酶技術(shù)以及寡核苷酸連接技術(shù)等

2、為目前常見(jiàn)的基因識(shí)別技術(shù)。其中酶依賴(lài)的識(shí)別技術(shù)憑借其操作簡(jiǎn)單，成本低，而且特異性高的優(yōu)點(diǎn)而受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。利用連接酶和恒溫?cái)U(kuò)增酶介導(dǎo)的基因識(shí)別技術(shù)則由于其適合識(shí)別任何位點(diǎn)的基因型而具備實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的潛力，成為目前識(shí)別技術(shù)發(fā)展的焦點(diǎn)。滾環(huán)擴(kuò)增作為一種可以大量擴(kuò)增核酸序列的方法被廣泛應(yīng)用，其既可進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增，又可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大擴(kuò)增。在等位基因檢測(cè)技術(shù)方面，比較傳統(tǒng)的方法有變性凝膠電泳，質(zhì)譜以及熒光檢測(cè)技術(shù)，這些方法具有高靈敏的優(yōu)點(diǎn)，

3、但由于實(shí)驗(yàn)操作繁雜，成本高限制了他們的普遍應(yīng)用。
　　 電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）分析方法是近些年發(fā)展起來(lái)的一種極高靈敏度的檢測(cè)方法，它有效地將電化學(xué)方法與化學(xué)發(fā)光結(jié)合于一體，利用三聯(lián)吡啶釕與三丙胺在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生高效，穩(wěn)定地發(fā)光，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、適用性廣等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫檢測(cè)和藥物分析中。
　　 實(shí)驗(yàn)中將高特異性滾環(huán)擴(kuò)增方法與高靈敏的電化學(xué)發(fā)

4、光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，發(fā)展了一種特異而靈敏的基因點(diǎn)突變分析技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的閉合探針、捕捉探針、信號(hào)探針，使基于酶連接反應(yīng)生成環(huán)狀的單鏈核酸序列，以此環(huán)狀單鏈核酸序列為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增最終生成長(zhǎng)的核酸序列，從而使大量的信號(hào)探針與之結(jié)合而提高了靈敏度。與信號(hào)探針雜交結(jié)合的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)鏈酶親和素和生物素的特異性結(jié)合被分離純后富集在電極表面直接進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，分離純化操作簡(jiǎn)單快速，而且具有富集的作用，提高了電化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)效率

5、。該方法的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到100 fM的水平，同時(shí)具有非常好的檢測(cè)特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可以作為一種靈敏度高，可靠性強(qiáng)的核酸突變檢測(cè)方法，并且有望發(fā)展成為臨床突變分析的方法。同時(shí)此方法在汞離子檢測(cè)中得到了擴(kuò)展應(yīng)用，在檢測(cè)中汞離子檢測(cè)靈敏度達(dá)到了100 pM的水平，同時(shí)還保持了非常好的離子選擇性。通過(guò)結(jié)合重金屬汞離子檢測(cè)驗(yàn)證了此方法具有非常好應(yīng)用延展性。這些結(jié)果說(shuō)明滾環(huán)擴(kuò)增和電化學(xué)發(fā)光方法的結(jié)合為各種小分子檢測(cè)提供一個(gè)高效率的途徑，