肉蓯蓉多糖中單糖組成分析的方法學(xué)研究.pdf

1、多糖是由十個(gè)及以上單糖以糖苷鍵結(jié)合而成的天然大分子物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等生物活性，多糖的諸多生物活性與一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，一級(jí)結(jié)構(gòu)是高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而單糖的組成又是多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，因此多糖中單糖組成的分析是研究多糖結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于多糖中單糖組成的分析方法文獻(xiàn)報(bào)道較多，但采用不同的分析方法測(cè)定同一種多糖中單糖組成的報(bào)道少。因此，本文采用三種色譜法-柱前衍生化氣相色譜法、柱前衍生化高效液

2、相色譜法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖的組成，為多糖中單糖組成分析方法的研究與應(yīng)用提供參考。
　　1、研究柱前衍生化氣相色譜法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖的組成。采用單因素實(shí)驗(yàn)，考察水解酸濃度、溫度和時(shí)間對(duì)肉蓯蓉多糖水解的影響；采用柱前衍生化氣相色譜法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖的組成。儀器條件:GC2010氣相色譜儀，DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.5μm)，檢測(cè)器為FID；氫氣和空氣的流速分別為37 mL/m

3、in和370 mL/min，氮?dú)饬魉? mL/min；升溫程序:130℃保持5 min，4℃/min程序升溫至240℃保持5 min；氣化室溫度為280℃；分流比為15:1；檢測(cè)器溫度300℃，進(jìn)樣量為1μL，肌醇為內(nèi)標(biāo)物。結(jié)果表明，肉蓯蓉多糖水解的最佳條件為硫酸濃度3.0 mol/L，水解時(shí)間8 h和水解溫度110℃；鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖在0.50-5.0 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，檢出限為0.5 mg

4、/L，相鄰兩峰鼠李糖和阿拉伯糖、阿拉伯糖和木糖、木糖和甘露糖、甘露糖和葡萄糖以及葡萄糖和半乳糖的分離度分別為1.02、1.05、5.64、1.00和1.17。各單糖6次測(cè)定的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD分別為0.92-4.68％、0.92-1.77%和1.61-3.61%，加樣回收率為99.3-100.3%，精密度較高，重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率較好；肉蓯蓉多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為2.01:5.72:2。此法樣品用

5、量少、重復(fù)性好和檢出限低，但本文方法不適用于多糖中含糖醛酸等酸性單糖組成的分析。
　　2、研究柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖的組成。與硫酸法水解多糖相比，三氟乙酸不僅可縮短多糖的水解時(shí)間，且水解后可用減壓蒸餾除去殘留的酸，對(duì)后續(xù)所用液相色譜柱的損傷小，因此本章采用三氟乙酸水解肉蓯蓉多糖。采用單因素實(shí)驗(yàn)，考察水解酸濃度、溫度和時(shí)間各因素對(duì)三氟乙酸水解肉蓯蓉多糖以及PMP甲醇濃度、溫度和時(shí)間衍生化條件的影響；采用高效液相

6、色譜法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖的組成。儀器條件:Agilent1200色譜分析系統(tǒng)，紫外檢測(cè)器，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6×250 mm，5μm)，流動(dòng)相為醋酸銨緩沖液(pH5.5):甲醇=78:22，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量5μL，等梯度洗脫。選用標(biāo)準(zhǔn)單糖木糖為內(nèi)標(biāo)物。結(jié)果表明，肉蓯蓉多糖水解的最佳條件為三氟乙酸2.0 mol/L，水解時(shí)間4 h和水解溫度120℃；衍生化的最優(yōu)條件為

7、PMP甲醇溶液0.5 mol/L，反應(yīng)時(shí)間40 min和反應(yīng)溫度70℃；甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖在0.5-5.0 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，檢出限為50 mg/L，相鄰兩峰甘露糖和鼠李糖、鼠李糖和葡萄糖、葡萄糖和半乳糖、半乳糖和阿拉伯糖以及阿拉伯糖和木糖分離度分別為1.99、4.45、1.98、2.57和3.43，分離度均大于1.5，相鄰兩峰完全分離。各單糖6次測(cè)定的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD分別為0.95

8、-4.93%、1.15-1.97%和1.81-3.72%，加樣回收率為99.2-100.9%，精密度較高，重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率較好；肉蓯蓉多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為1.98:5.61:1.95。此法分離效能高、重復(fù)性好，選用PMP作衍生化試劑，反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短，可用于多糖中還原單糖組成的測(cè)定。
　　3、研究高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定肉蓯蓉多糖單糖組成。采用單因素實(shí)驗(yàn)，考察漂移管溫度、載氣流量對(duì)儀

9、器工作條件的影響，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定肉蓯蓉多糖中單糖的組成。本章采用三氟乙酸水解肉蓯蓉多糖，儀器條件:Agilent Technologies色譜分析系統(tǒng)，色譜柱為Hypersil NH2(4.6 mm×250mm，5μm)，柱溫40℃；流動(dòng)相:A乙腈，B水，梯度洗脫程序:0-1 min，80%A；1-5 min，80%A-90%A；5-6 min，90%A；6-20 min，90%A-80%A；20-42 min，80

10、%A；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10μL；選用標(biāo)準(zhǔn)單糖木糖為內(nèi)標(biāo)物。結(jié)果表明，最佳條件為漂移管溫度為60℃，載氣為高純氮?dú)?，載氣流速為1.2 mL/min，增益為1。鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和木糖在進(jìn)樣量15-480 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系較好，阿拉伯糖和半乳糖在進(jìn)樣量10-320 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系較好，檢出限為1.0-1.5 mg/L，相鄰兩峰鼠李糖和葡萄糖、葡萄糖和阿拉伯糖、阿拉伯糖和甘露糖、甘露糖和木糖以及木糖和半乳糖的分離

11、度分別為1.14、1.40、1.69、1.25和2.90，各單糖的6次的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性RSD分別為0.65-1.69%、1.16-4.16%和1.83-1.96%，加樣回收率為96.8-98.9%，精密度較高，重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率較好。肉蓯蓉多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為2.03:5.66:1.92。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法無(wú)需衍生化，操作簡(jiǎn)單、精密度高、檢測(cè)限較低，適用于測(cè)定多糖中所有種類(lèi)的單糖。