紅松松子殼多糖的提取純化、組成分析及抗氧化活性研究.pdf

1、紅松(Pinus koraiensis)系松科松屬植物，在我國東北地區(qū)分布廣泛，松子殼是摘除松子后的松球鱗片，多被丟棄或焚燒?，F(xiàn)有研究表明紅松松子殼中的多糖(Pinus koraiensis Pinon Shell Polysaccharides，PPSP)具有抗腫瘤、抗病毒等多種活性，因此對該多糖成分進(jìn)行提取、分離純化以及生物活性研究具有重要意義。
　　本課題對紅松松子殼多糖的提取工藝優(yōu)化、膜分離聯(lián)用柱層析技術(shù)分離純化、抗氧化活

2、性測定、以及其單糖組成研究、結(jié)構(gòu)特征初步分析、含量測定方法改進(jìn)等多方面進(jìn)行了系列研究，主要內(nèi)容如下:
　　1、對多糖含量測定方法—DNS法（3，5二硝基水楊酸法）做出了重要改進(jìn)。DNS法具有許多突出優(yōu)點，然而對于是否選用供試液最大吸收波長作為其測定波長卻存在顯著分歧（反對采用最大吸收波長者認(rèn)為在該波長處測定時會出現(xiàn)顯色劑強(qiáng)吸收所帶來的嚴(yán)重干擾），本實驗中對此進(jìn)行了探索性研究，并首次報道了有關(guān)該爭議的針對性評述和相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)支持。

3、
　　經(jīng)系列實驗后得知，導(dǎo)致以上測定波長爭議的根本原因并非波長因素，其本質(zhì)在于空白溶液設(shè)計是否得當(dāng);上述顯色劑干擾是以蒸餾水為空白所致，選用顯色劑做空白即可有效排除，舍棄供試液最大吸收波長而另選測定波長既不必要，也容易增大分析誤差。本實驗中的紅松松子殼多糖DNS法含量測定的適宜波長為供試液最大吸收波長500nm，同時必須以顯色劑做空白溶液，另選測定波長或者改用蒸餾水為空白所得實驗數(shù)據(jù)明顯有誤。以上結(jié)果對于其它多糖或還原糖的DNS法

4、含量測定也可提供參考。
　　2、對紅松松子殼多糖的提取工藝進(jìn)行了條件優(yōu)化研究，以多糖產(chǎn)率為指標(biāo)，探索了提取時間、提取次數(shù)以及料液比等不同因素對提取效果的影響規(guī)律，此后又進(jìn)行正交設(shè)計試驗優(yōu)選出最佳提取工藝:料液比1∶15(g/ml)，提取時間2h，提取3次，各因素對紅松松子殼多糖產(chǎn)率影響的主次順序為:料液比＞提取次數(shù)＞提取時間，在優(yōu)化工藝條件下多糖產(chǎn)率可達(dá)2.9％。
　　3、經(jīng)上述優(yōu)化工藝提取的紅松松子殼粗多糖，再經(jīng)吸附精制等

5、處理后，進(jìn)行膜分離純化，又經(jīng)木瓜蛋白酶結(jié)合Sevage法脫蛋白，D101大孔樹脂脫色后得到紅松松子殼總多糖，由此形成一條易于實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的工藝路線。
　　本實驗中還將膜分離技術(shù)與離子交換纖維素柱層析聯(lián)用，將上述紅松松子殼總多糖進(jìn)行分離后得到四個組分，分別命名為PPSPⅠ-1、PPSPⅠ-2、PPSPⅠ-3和PPSPⅠ-4，成功建立了對總多糖進(jìn)一步分離分級的制備方法。
　　4、對上述紅松松子殼總多糖及其純化組分進(jìn)行了單糖組成

6、研究和結(jié)構(gòu)特征初步分析。
　　氣相色譜結(jié)果表明:紅松松子殼總多糖PPSPⅠ-b是由鼠李糖、木糖等至少六種單糖組成的雜多糖，其摩爾比是:鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=3.40∶1.40∶0.79∶7.82∶10.67∶18.35;PPSPⅠ-1與PPSPⅠ-2皆是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成的雜多糖，兩者摩爾比顯著不同;PPSPⅠ-4僅檢測出一種單糖—葡萄糖，以上四組樣品的GC譜圖中均有一個

7、色譜峰因缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品暫未鑒別歸屬，推測可能為其它單糖。
　　紅外光譜分析表明四種多糖純化組分(PPSPⅠ-1、PPSPⅠ-2、PPSPⅠ-3和PPSPⅠ-4)均具有糖類的特征吸收峰，各組分的單糖均為吡喃糖，其糖苷鍵構(gòu)型存有差異，PPSPⅠ-1與PPSPⅠ-2組分結(jié)構(gòu)中只存在α-構(gòu)型糖苷鍵;PPSPⅠ-3組分中既有α-構(gòu)型糖苷鍵又有β-構(gòu)型糖苷鍵;PPSPⅠ-4組分結(jié)構(gòu)中只存在β-構(gòu)型糖苷鍵。此外PPSPⅠ-2、PPSPⅠ-3和

8、PPSPⅠ-4均推測為酸性多糖，這與其在DEAE-52離子交換纖維素柱層析中的層析行為也相符合。
　　5、對來自不同制備過程的五種紅松松子殼多糖樣品PPSPⅠ、PPSPⅡ、PPSPⅠ-a、PPSPⅠ-b、PPSPⅠ-2進(jìn)行體外抗氧化活性研究，并且得到了富有明顯規(guī)律性的結(jié)果。
　　研究結(jié)果表明:該五種紅松松子殼多糖樣品均有一定的體外抗氧化活性，并發(fā)現(xiàn)該活性與其用量呈正相關(guān)。不同多糖組分對·OH和DPPH·具有相似的清除規(guī)律，清

9、除能力強(qiáng)弱依次為:Vc＞PPSPⅠ（膜分離所得總多糖）＞PPSPⅡ（醇沉法所得總多糖）＞PPSPⅠ-a（膜分離所得總多糖又脫蛋白）＞PPSPⅠ-b（膜分離所得總多糖又脫蛋白、脫色）＞PPSPⅠ-2(DEAE-52柱層析所得的多糖組分之一)。由此可知，膜分離所得總多糖PPSPⅠ抗氧化活性最強(qiáng)，脫蛋白后活性明顯減弱，再脫色后活性繼續(xù)下降，DEAE-52柱層析所得的多糖組分之一PPSPⅠ-2的活性，顯著弱于柱層析純化前的各樣品。
　　在