海洋產(chǎn)黃青霉低溫堿性蛋白酶的純化、性質(zhì)分析及其基因的克隆.pdf

1、該實驗旨在找尋在低溫下有較高酶活但對中高溫敏感的一種蛋白酶以期應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中來降低能耗,提高產(chǎn)品質(zhì)量.我們從海底污泥中分離到21株產(chǎn)蛋白酶絲狀真菌,將其中一株產(chǎn)蛋白酶酶活較高的產(chǎn)黃青霉菌株,命名為Penicillium chrysogenum FS010441,對其生長的適冷性和它產(chǎn)生的蛋白酶的適低溫特性進行了研究,并對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化.該菌株能夠在5℃下生長,其最適生長溫度為20℃,最高生長溫度低于40℃,為一株適冷菌.在15℃

2、時其產(chǎn)酶量最高,在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,活力達到176u/ml.對該酶進行純化及性質(zhì)研究,確定其最適反應(yīng)溫度為35℃,比一般工業(yè)應(yīng)用真菌蛋白酶之最適溫度低10~15℃.該酶熱敏感性強,當(dāng)溫度高于50℃時,該酶易失活;60℃保溫5min后只殘存10﹪酶活力,保溫10min后酶活力幾乎完全喪失.但在10℃保溫30min仍然有86﹪酶活殘留.其最適pH為9,在pH8-11范圍內(nèi)活力較高,酶反應(yīng)條件溫和.Ca<'2+>、Mg<'2+>對酶活

3、力的提高有一定作用,而Cu<'2+>、Co<'2+>對酶有抑制作用,DEP和PMSF對酶的抑制作用比較明顯.SDS-PAGE法測得該酶表觀分子量為41000±1000Da.利用PCR技術(shù),根據(jù)EMBL公開的Penicllium chrysogenum基因組DNA序列設(shè)計合成了PCR所需引物,以Penicllium chrysogenum FS010441染色體DNA為模板,擴增出目的基因,構(gòu)建了重組質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)入E.coliDH5α.