新型低溫堿性蛋白酶的純化和性質(zhì)研究.pdf

1、蛋白酶是三大工業(yè)用酶之一，產(chǎn)值約占國際酶市場的60％。由于其在洗滌，皮革，絲綢，醫(yī)藥、食品、廢物處理、小肽合成等各個行業(yè)表現(xiàn)出的廣闊應(yīng)用前景及巨大商業(yè)價值，蛋白酶一直是國內(nèi)外研究的熱點。
　　 本研究從土壤中篩選到一株低溫堿性蛋白酶生產(chǎn)菌，其生理生化性質(zhì)與Pseudomonas mosselii相近，經(jīng)16s rDNA鑒定與Pseudomonas mosselii相似性高達(dá)99％，將其命名為Pseudomonas mosseli

2、i XG1。
　　 研究發(fā)現(xiàn)P.mosselii XG1蛋白酶在低溫下穩(wěn)定性良好，并在常溫或低溫下能有效降解發(fā)酵液中的雜蛋白。利用此性質(zhì)將Pseudomonas mosselii XG1發(fā)酵液在4℃下放置72h后經(jīng)硫酸銨分級沉淀一步純化得到電泳純的蛋白酶，其亞基分子量為45KDa。比活力為2499.5U/mg，純化倍數(shù)為3.56，純化回收率達(dá)到50.7％。
　　 P.mosselii XG1蛋白酶最適pH為9.0，在很寬

3、的pH范圍(pH5.0-12.0)內(nèi)保持高活力；44℃時活性最高，熱穩(wěn)定性較差，Ca2+能顯著改善酶的熱穩(wěn)定性。Mn2+對酶活有顯著促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+則有微弱抑制作用。金屬蛋白酶抑制劑1，10-菲咯啉對酶活有抑制，表明活性中心附近可能有Zn2+離子。絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)對酶活力沒有影響，表明該酶可能不屬于絲氨酸蛋白酶家族。5mmol/L的二硫蘇糖醇抑制了50％的酶活，說明二硫鍵可能是穩(wěn)定該蛋白酶三級結(jié)構(gòu)所必需。以酪

4、蛋白酸水解物為底物測得P.mosselii XG1蛋白酶的米氏常數(shù)Km為0.607mg/ml，最大反應(yīng)速率υmax為763.359U/ml。
　　 XG1蛋白酶的底物選擇性研究表明該蛋白酶不易水解各種氨基酸對硝基苯胺的衍生物(常用人工底物)，較易剪切長鏈的肽鏈。以氧化型牛胰島素B鏈為底物檢測P.mosselii XG1蛋白酶的切割特異性，反應(yīng)3min時，蛋白酶的優(yōu)先切割位點為Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr

5、16-Leu17；反應(yīng)60min后，蛋白酶的酶切位點為Asn3-Gln4，Gln4-His5，Cys7-Gly8，Glu13-Ala14，Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr16-Leu17，Tyr26-Thr27。
　　 P.mosselii XG1蛋白酶對鰲合劑EDTA、氧化劑暨漂白劑H2O2和表面活性劑SDS耐受性良好。與各種商業(yè)洗滌劑放置30min后測定酶活，奧妙()洗衣粉對酶活力影響最大，處理后殘余酶