狂犬病病毒M蛋白在桿狀病毒中的表達、純化及生物學特性初步研究.pdf

1、狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV）引起的一種人獸共患病。人和大多數溫血動物易感，臨床上以怕光，精神沉郁，進行性麻痹和最終死亡為主要特征，致死率幾乎100％。RV有N、P、M、G和L共5種結構蛋白，其中，G蛋白是決定RV致病性的關鍵蛋白。許多研究表明G蛋白某些氨基酸位點的突變會改變RV的致病性以及病毒的一些生物學屬性，如胞間擴散，膜融合，誘導細胞凋亡等。而RV其它蛋白對其致病性是否有影響卻知之甚少。20

2、06年， Shimizu K等人利用反向遺傳學技術把Ni-CE（由固定毒株Nishigahara在雞胚成纖維細胞中連續(xù)傳100代后獲得的，對成年小鼠無致病性）M蛋白基因替換成Nishigahara株（固定毒株，腦內接種可致死成年小鼠）M蛋白基因后，重組病毒CE（NiM）重新獲得了致病力，腦內接種可致死成年小鼠。此結果為人們對RV致病機制的深入研究打開了新的篇章。因此，從多個角度進一步探討M蛋白對RV致病性的影響對于明確RV的致病機制和有

3、效防控狂犬病具有重要意義。
　　本研究以探討單獨的M蛋白接種對RV致病性的影響為目的，進行了如下試驗：
　　1．表達狂犬病病毒M蛋白的重組桿狀病毒的構建和鑒定。試驗內容：①以RT-PCR技術擴增狂犬病病毒BD06株M蛋白基因；②將M蛋白基因序列插入桿狀病毒載體質粒pFastBac I中，構建重組質粒pFastBac I-M；③用鑒定正確的重組質粒pFastBac I-M轉化DH10 Bac E.coli感受態(tài)菌，構建重組穿梭

4、質粒Bacmid-M，并以PCR法鑒定；④以脂質體Lipofectamine2000介導重組穿梭質粒Bacmid-M轉染Sf9昆蟲細胞，獲取重組桿狀病毒AcMNPV-M，取細胞病變上清，以電鏡觀察重組病毒形態(tài)；⑤用小鼠抗His標簽單克隆抗體、兔抗RV陽性血清和犬抗RV陽性血清通過Western Blot方法鑒定重組M蛋白的表達及其反應原性。
　　2．重組M蛋白的純化及多克隆抗體的制備。試驗內容：①利用鎳離子親和層析柱純化重組M蛋白

5、；②用純化的重組M蛋白免疫大耳白兔，每次免疫后1周，耳緣靜脈采血并分離血清；③通過Western Blot試驗分析兔抗M蛋白多克隆抗體同狂犬病病毒aG株、PV2061株、SRV9株、CVS-11株、ERA株和BD06株M蛋白之間是否存在交叉反應；④以FAVN試驗測定兔抗M蛋白多克隆抗體是否具有病毒中和活性。
　　3．M蛋白生物學特性初步研究。以探索接種M蛋白后對腦內與外周攻毒小鼠潛伏期、發(fā)病率的影響為目的。具體試驗步驟如下：①將實

6、驗動物隨機分為腦內攻毒組和外周攻毒組兩個大組，兩組中又分別設立了高劑量攻毒組和低劑量攻毒組；②將純化的M蛋白與等體積油佐劑混合后分別于0d，7d，14d通過腹腔注射免疫四個大組中的小鼠，同時大組內設立透析液組、AcMNPV組作為對照；③第3次免疫后，于第5天對小鼠進行斷尾采血并分離血清，用Western Blot試驗分析重組M蛋白免疫原性；④第3次免疫后1周，對兩大組小鼠分別進行腦內和外周肌肉注射攻毒試驗，攻毒后連續(xù)觀察14天，記錄小鼠

7、攻毒后的潛伏期、發(fā)病數以及死亡數。
　　通過以上試驗，獲得以下結果：
　　1.成功構建了重組桿狀病毒AcMNPV-M，且該重組病毒電鏡下具有典型的桿狀病毒形態(tài)，其感染Sf9昆蟲細胞后，通過SDS-PAGE試驗鑒定，重組桿狀病毒表達了一約25kD的蛋白，用小鼠抗His標簽單抗、兔抗RV陽性血清和犬抗RV陽性血清通過Western Blot試驗對其反應原性鑒定，在25kD附近也出現了單一的條帶。
　　2.變性條件下純化的重

8、組M蛋白SDS-PAGE條帶單一，純度良好；透析復性后，以該純化M蛋白免疫大耳白兔制備的兔抗M蛋白多克隆抗體與現有主要狂犬病疫苗株及流行毒株M蛋白反應性能良好，Western Blot鑒定結果顯示在25 kD左右均出現了一特異性條帶；FAVN試驗結果顯示，兔抗M蛋白多克隆抗體的病毒中和效價為0。
　　3.小鼠攻毒試驗結果顯示，單獨接種M蛋白后，腦內接種3 LD50或50 LD50狂犬病病毒CVS-24株時，不同小組動物的潛伏期、發(fā)

9、病和死亡率均無明顯差異；外周接種100 LD50狂犬病病毒BD06株時，AcMNPV-M組的小鼠全部發(fā)病，透析液組和AcMNPV組小鼠死亡率為80%（8/10）；外周接種3 LD50狂犬病病毒BD06株時，AcMNPV-M組、透析液組和AcMNPV組的小鼠均無發(fā)病。
　　通過以上研究結果，得出以下結論：
　　1.成功構建了重組桿狀病毒AcMNPV-M，且該重組病毒表達的M蛋白具有良好的反應原性，為后續(xù)研究M蛋白其它生物學特性

10、奠定了物質基礎。
　　2.可用鎳離子親和層析法對桿狀病毒表達的M蛋白進行純化；重組M蛋白免疫原性良好；制備的兔抗M蛋白多克隆抗體與現有狂犬病疫苗株及流行毒株均有良好反應性；M蛋白誘導機體產生的抗體無病毒中和活性。
　　3.單獨的M蛋白接種對不同組別中腦內攻毒小鼠的潛伏期、發(fā)病率和死亡率的均無明顯影響；對不同劑量外周攻毒的小鼠的潛伏期也無明顯影響，但有提升小鼠的發(fā)病率的趨勢。提示單獨接種M蛋白可能會影響狂犬病病毒致病性。