表達PRV-vp4基因的重組桿狀病毒和重組偽狂犬病毒的構建.pdf

1、豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PRV)屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一，1-4周齡仔豬的發(fā)病率超過80％，死亡率可達20％，該病在世界范圍內(nèi)分布，其感染引發(fā)的腹瀉已發(fā)展成為一種世界性的疾病，給各國的畜牧業(yè)造成了嚴重的危害，有效的疫苗接種是目前預防該病的唯一途徑，而現(xiàn)有疫苗存在著易發(fā)生毒力回復、異型間免疫效果差的缺憾。偽狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PrV)屬于皰疹病毒甲亞科水痘

2、病毒屬，病毒在豬群中的傳播引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙及呼吸系統(tǒng)疾病，有傳播速度快、傳播途徑多、流行范圍廣、致死率高的特點，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，在偽狂犬病的防控中廣泛使用的Bartha-K61株等弱毒疫苗被證明是疫苗研制成功的典范，目前研究熱點正轉為利用生物技術研制重組偽狂犬病毒活載體疫苗方面。 本研究中，首先進行了PRV/JL94株的細胞培養(yǎng)和超離純化，并提取病毒核酸進行研究。根據(jù)學者們的觀點：vp4基因對輪狀病毒的致

3、病力起著關鍵性的作用；VP4還是重要的中和性抗原，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，對機體有免疫保護作用；一個VP4血清型別可能包含幾個VP7型別，因此選定vp4基因片段研發(fā)疫苗，能減少不同型別間免疫效果差的問題，對疾病的防控更有現(xiàn)實意義。學者們認為，vp4基因5端長750bp的特異性片段主要決定其生物特性，是vp4的主要抗原功能結構區(qū)。所以，本研究根據(jù)JL94/vp4全基因序列，通過RT-PCR技術克隆其5端1-756bp(包括全部的VP8區(qū)

4、、胰酶區(qū)和VP5的N端)，命名為vp4主要抗原位點基因(vp4MajorAntigenSiteGene，vp4-MASG)并進行序列分析，結果表明vp4-MASG基因片段與國外分離株CRW-8株、Gottfried株同一基因片段氨基酸同源性分別是96.43％和67％。同型之間高度保守，不同型間差別較大，其中aa81-207變異性最大。 將vp4-MASG同載體pMelBacA連接，與LinearAcMAPV/DNA共轉染昆蟲細胞

5、Sf9，通過3代蝕斑純化，篩選出含有vp4-MASG基因的重組桿狀病毒并表達出目的蛋白，光密度掃描分析證實所表達蛋白占細胞總蛋白的26％；WesternBlotting顯示所表達的蛋白有較好的免疫反應性；經(jīng)純化的表達蛋白免疫小鼠所得血清能阻止PRV在MA104細胞上形成的細胞病變，說明表達蛋白有免疫原性。構建的表達PRV/vp4基因的重組桿狀病毒可以作為亞單位疫苗侯選株，它不含有輪狀病毒核酸，不存在毒力回復問題，高安全性和高表達量是其最

6、大特點。 輪狀病毒性腹瀉和偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)的兩大重要傳染病，是否可以利用成功的偽狂犬病毒疫苗株作為活載體表達輪狀病毒基因，力爭同時防治這兩種疾病呢。實驗中，將vp4-MASG插入到本課題組構建的gG偽狂犬病毒轉移載體多克隆位點上，該轉移載體以偽狂犬病毒非必需基因的部分序列作為同源臂，在其間插入gGPromoter、多克隆位點、PolyA、CMVPromoter及其控制的LacZ基因，構建出含有目的基因vp4-MASG和報告基

7、因LacZ的轉移載體vp4-MASG-gG；將其與PrV弱毒疫苗株Bartha-K61株(gE-/gI-)病毒基因組DNA，通過脂質(zhì)體法共轉染Vero細胞，經(jīng)顯微鏡下挑斑技術的篩選純化及PCR鑒定，獲得了一株表達目的基因的重組偽狂犬病毒，命名為vp4-MASG-PrV；生長動力學實驗顯示重組病毒vp4-MASG-PrV在Vero和IBRS2細胞上的毒價與親本病毒Bartha-K61無顯著差異，重組病毒去除了偽狂犬病毒的主要毒力基因gG，

8、理論上會使毒力進一步降低而安全性提高，但由于PrV的毒力由多個毒力基因決定，所以單獨某些基因的缺失，不足以引起顯著的毒力降低；重組病毒和親本病毒在同種細胞上引起相似的細胞病變形態(tài)，不同的細胞系中產(chǎn)生的CPE形態(tài)不同，CPE形態(tài)與病毒無關只與細胞系相關，說明外源基因的插入并未導致細胞病變的形態(tài)變化；表達動力學實驗顯示，vp4-MASG-PrV在Vero細胞中表達出與預期大小相符合的28kDa蛋白；WesternBlotting實驗和間接免

9、疫熒光實驗顯示，vp4-MASG-PrV感染細胞15h后VP4蛋白即可通過WesternBlotting在被感染的細胞中檢測到，而病毒上清中未檢測，另一方面被感染細胞的可以用輪狀病毒抗體檢測到胞漿熒光，而病毒上清中沒有熒光，說明在表達特性方面，所表達蛋白主要分泌到感染細胞的胞漿中/胞膜上，并且所表達蛋白有免疫反應性；將Balb/C小鼠分為2組，分別肌肉注射vp4-MASG-PrV和生理鹽水對照，兩次免疫后取血清進行ELISA實驗，結果顯

10、示重組病毒在機體中有效地激發(fā)了特異性抗輪狀病毒抗體的產(chǎn)生，有較好的免疫原性。重組偽狂犬病毒在生物學活性上與作為疫苗株的親本病毒無明顯差異，同時它有較好的免疫反應性和免疫原性，表型特征為gE-/gI-/gG-/vp4+/LacZ+，是有必要進一步完善數(shù)據(jù)、進行動物實驗，有應用前景的同時預防兩種疾病的重組活載體病毒。 整體實驗中，構建出表達PRV/vp4基因的重組桿狀病毒和重組偽狂犬病毒，它們有各自的特點：作為亞單位疫苗侯選株的重組