人FGF8b蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:通過昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組人成纖維細(xì)胞生長因子-8b(FGF-8b)，優(yōu)化表達(dá)條件，純化后研究其對(duì)1-甲基4-苯基吡啶(MPP+)誘導(dǎo)建立的帕金森(Parkinson disease，PD)病細(xì)胞模型的保護(hù)作用及其抗凋亡機(jī)制。
　　方法:目的基因FGF8b和轉(zhuǎn)移載體pFastbac雙酶切后連接，連接產(chǎn)物pFastbac-FGF8b鑒定后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，目的基因同源轉(zhuǎn)座至Bacmid中，通過藍(lán)白

2、斑實(shí)驗(yàn)重復(fù)篩選獲得高純度穿梭載體Bacmid-FGF8b。重組陽性質(zhì)粒通過脂質(zhì)體包裝后轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，收獲的病毒重復(fù)轉(zhuǎn)染擴(kuò)大病毒滴度。收獲的蛋白用SDS-PAGE，Western blot進(jìn)行鑒定。為了提高蛋白產(chǎn)量，分別對(duì)病毒侵染時(shí)間和侵染病毒滴度進(jìn)行探索優(yōu)化。在最佳表達(dá)條件下收獲細(xì)胞沉淀超聲破碎后通過肝素親和層析柱純化獲得目的蛋白FGF8b。NIH3T3細(xì)胞檢測(cè)蛋白促增殖作用。為了研究FGF8b的神經(jīng)保護(hù)作用，利用MPP+誘導(dǎo)PC

3、-12細(xì)胞建立帕金森細(xì)胞模型檢測(cè)其促增殖和抗凋亡作用，并進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot確定其抗凋亡作用機(jī)制。
　　結(jié)果:人FGF8b成功在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，肝素純化后蛋白純度＞90％，蛋白產(chǎn)量為2.78mg/L。細(xì)胞活性檢測(cè)證實(shí)純化的重組蛋白能顯著促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞生長，在0.5 ng/ml～64ng/ml之間呈劑量依賴性。FGF8b對(duì)帕金森細(xì)胞模型有保護(hù)作用，并且FGF8b通過與FGFR3結(jié)合降低MPP+誘導(dǎo)