人博卡病毒HBoV結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆、原核表達(dá)、純化及VP1在桿狀病毒中的表達(dá).pdf

1、下呼吸道感染能引起兒童高發(fā)病率，是導(dǎo)致兒童死亡的重要病因之一。在2005年10月瑞典科學(xué)家Allander等從下呼吸道感染嬰幼兒的分泌物中發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)小病毒，它是人支氣管炎的一種病原體，該病毒能引起兒童上、下呼吸道感染，甚至可引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。從分子生物學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和流行病學(xué)等多方面綜合研究表明，該病毒具有細(xì)小病毒亞科的基本特征，并與細(xì)小病毒亞科的博卡病毒屬成員結(jié)構(gòu)特征相似，從而將其歸類為博卡病毒屬的新成員，并命名為人博卡

2、病毒。
　　 人博卡病毒是一種無包膜的、單鏈DNA病毒，基因組DNA長度大約5299 nt，它是繼細(xì)小病毒B19之后發(fā)現(xiàn)的第二種對(duì)人類致病的細(xì)小病毒，到目前為止已有18個(gè)國家和地區(qū)的研究者證實(shí)了人博卡病毒感染在兒童呼吸道疾病中普遍存在，部分研究者還在血清、糞便以及尿液的標(biāo)本中也檢測到了人博卡病毒，推測該病毒與胃腸道疾病有關(guān)。人博卡病毒可以單獨(dú)感染，也可以與其他病毒混合感染，感染可全年發(fā)生，但深秋、冬季和早春為感染多發(fā)季節(jié)。目前對(duì)

3、人博卡病毒生物學(xué)特性及其在人類疾病中的意義仍不清楚。
　　 本文根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室克隆得到的大片段人博卡病毒序列設(shè)計(jì)VP1和VP2引物(該序列已經(jīng)提交GeneBank，登錄號(hào)為：GU139423)，通過PCR擴(kuò)增得到結(jié)構(gòu)蛋白基因。并將VP1和VP2基因分別都克隆到原核表達(dá)載體pMAL-c2X和pET28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 d和BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，通過Westen Blot檢測目的蛋白的表達(dá)。利用Amy

4、lose親和層析柱和Ni柱純化目的蛋白，并用純化后得到的目的蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，從而為進(jìn)一步研究該病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制提供可靠的工具。
　　 此外，為了弄清楚結(jié)構(gòu)蛋白VP1獨(dú)特區(qū)(VP1-u)是否可以單獨(dú)表達(dá)，還是從整個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP1表達(dá)后被裂解下來的。本實(shí)驗(yàn)將人博卡病毒主要衣殼蛋白基因VP1克隆到桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體(pFastBacHTA)，通過轉(zhuǎn)座獲得重組Bacmid DNA，用這種DNA轉(zhuǎn)染