昆蟲桿狀病毒表達的狂犬病毒G蛋白間接ELISA檢測方法的研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒引起的重要的人獸共患病，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，人和動物一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100％。野生動物是本病的主要天然儲存宿主，犬是人狂犬病的最主要傳染源。近年來該病在我國的發(fā)生呈逐年上升的趨勢，已成為嚴重危害我國公共衛(wèi)生的重大疫病。 隨著動物國際貿(mào)易需求的增加，為控制全球日益嚴峻的狂犬病疫情，國家與國家之間對于進出境口岸的犬、貓等動物也要進行嚴格的檢疫監(jiān)管，要求動物必須接種狂犬病疫苗，并且中和抗體效價

2、要高于國際標準(0.5 IU/ml)才允許其進出境。因此世界衛(wèi)生組織和國際獸疫局(OIE)把這一國際單位(0.5 IU/ml)作為疫苗免疫后血清中和抗體效價的最低標準。但是由于各國的疫苗種類、質(zhì)量、工藝、所用的佐劑以及免疫時間、次數(shù)不同，即使已經(jīng)免疫的動物也存在著中和抗體的差異，因此急需建立一種更加快速的方法來檢測免疫動物的中和抗體水平。 現(xiàn)有的狂犬病中和試驗操作繁瑣，需時較長，要求條件高，不適宜口岸快速檢測的需求，因此急需建立

3、一種與進出境檢驗檢疫相適應的快速、敏感、特異的方法來代替中和試驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗方法因其敏感、特異、快速，因而在進出境口岸動物疫病檢驗檢疫中得到了廣泛應用。目前國內(nèi)外已有報道用ELISA方法可以檢測狂犬病毒抗體，但是針對狂犬病毒中和抗體檢測方法的研究未見報道。 本研究利用已純化的狂犬病毒糖蛋白作為包被抗原，通過條件優(yōu)化，建立了間接ELISA方法，并用該方法對狂犬病疫苗免疫后不同時期血清中的中和抗體進行檢測。 條件優(yōu)化后

4、，間接ELISA方法各項反應參數(shù)如下：抗原包被量為0.3μg/ml；包被條件為37℃，2h后4℃過夜；血清的最佳稀釋倍數(shù)為40倍；HRP-兔抗犬IgG的最佳工作濃度為1：2000；最佳封閉液采用1％濃度的卵清蛋白；封閉條件為37℃，2h；血清樣品的稀釋液選用1％濃度的卵清蛋白；酶標抗體的稀釋液也選用1％濃度的卵清蛋白。待檢血清，酶標二抗的反應時間均為1h，底物反應的時間為10min。陰陽臨界值確定為0.252。 之后，利用OIE

5、指定的檢測狂犬病毒中和抗體的方法，即熒光抗體病毒中和試驗與ELISA進行對比，分別利用兩種方法對疫苗免疫后不同時期的376份犬血清進行檢測和分析，結果用熒光抗體病毒中和試驗檢測，有299份為陽性，77份為陰性，而用間接ELISA方法檢測，有282份為陽性，94份為陰性。間接ELISA方法的特異性為100％，敏感性為94.31％，與熒光抗體病毒中和試驗結果的符合率為95.48％。經(jīng)統(tǒng)計學方法分析，兩種方法的差異不顯著，從而進一步證實建立的