嬰兒生后糞便微生物區(qū)系的演變.pdf

1、目的:腸道微生物在營養(yǎng)代謝、免疫系統(tǒng)成熟以及促進腸粘膜屏障的完善中起重要作用，腸道微生物群多樣性或結(jié)構(gòu)的改變與多種疾病有關(guān)，嬰兒時期是腸道微生物群定植、演替的重要階段，嬰兒時期腸道微生物群定植模式可持續(xù)至成年。以往對于腸道微生態(tài)的研究多采用培養(yǎng)或分子生物學(xué)技術(shù)，對于腸道微生物群的多樣性研究有明顯的局限性，隨著第二代高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，以其測序快、準確度高等特點逐漸應(yīng)用于腸道微生物的研究，這些研究大多在歐美國家完成，中國此方面文獻報道不

2、多，且樣本量少，結(jié)果差異性較大，不能全面體現(xiàn)嬰兒腸道微生物區(qū)系的定植及演變?nèi)^程。本研究旨在通過Illumina Miseq高通量測序平臺對嬰兒多個時間段的糞便微生物群進行DNA測序，探討嬰兒生后糞便微生物區(qū)系的定植和演變過程，為今后腸道微生物群系變化與遠期疾病的發(fā)生風(fēng)險提供理論依據(jù)。
　　方法:選擇2013年11月-2015年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院和石家莊市第四人民醫(yī)院出生的符合入組標準的新生兒30例，均為陰道分娩、母乳喂養(yǎng)

3、、家中成員無過敏史，母親圍產(chǎn)期未應(yīng)用抗生素，嬰兒及其雙親均生活在石家莊市或其周邊縣市，氣候環(huán)境，居住環(huán)境，飲食環(huán)境等相當。收集其嬰兒出生后第1、3、7天，第1個月、3個月和第6個月齡時的糞便標本（分別設(shè)定為A-F組），凍存于-80℃冰箱，并隨訪入組嬰兒上述時間段的喂養(yǎng)狀況、健康情況及用藥情況（抗生素及益生菌制劑）。采用OMEGA E.Z.N.A試劑盒提取糞便標本中DNA，通過Illumina MiseqPE250高通量測序平臺對細菌16

4、S rRNA的V3-V4可變區(qū)域進行測序，應(yīng)用Mothur軟件對測得序列進行OTU聚類，分析腸道菌群的豐度及多樣性，在門及屬水平對嬰兒生后腸道微生物區(qū)系進行詳細描述，并結(jié)合隨訪情況，分析出現(xiàn)變異原因。
　　結(jié)果:
　　1、入組嬰兒30例，收集其嬰兒出生后第1、3、7天，第1個月、3個月和第6個月齡時的糞便標本，應(yīng)收集標本180份標本，但實際收集158個標本，因各種原因脫落22個，脫落率為12％。其中15個糞便標本提取DNA失

5、敗，11個標本擴增失敗，共計132個糞便標本進入測序程序，測得總序列5143376，總堿基數(shù)3096312352bp，經(jīng)過濾及篩選后，共獲得優(yōu)化序列為2717040，總堿基數(shù)為1206679948bp，平均長度444.12bp。
　　2、對測得序列進行隨機抽樣，以抽到的序列數(shù)與所代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，此曲線趨于平坦，說明所測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度足夠，能覆蓋腸道菌群97％的菌種。通過Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)隨著時間的推移

6、逐漸增大，顯示糞便微生物豐度逐漸增多，Shannon指數(shù)逐漸增大、Simpson指數(shù)逐漸減小提示生后隨時間推移，糞便樣本中菌群多樣性逐漸增加。
　　3、對132個糞便標本進行測序，共測得17個門，181個屬。其中在門水平上，占微生物區(qū)系99％的有5個門，分別為Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）Fusobacter

7、ia（梭菌門）。主要屬包括:Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Lactococcus(乳球菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Enterococcus(腸球菌屬)、Escherichia-Shigella（大腸埃希菌-志賀菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）Klebsiella（克雷伯氏菌屬）Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）等，共計181個屬。
　　4、嬰兒腸道微生物群定植及演變過程:<

8、br>　　4.1嬰兒出生后隨時間段推移，門水平上變化:Proteobacteria（變形菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）含量呈下降趨勢，Proteobacteria從出生第一天的46.5％，經(jīng)過6個月后下降至24％; Firmicutes從出生第一天的45.3％，經(jīng)過6個月后下降至23.3％。與之相反，嬰兒出生后Actinobacteria（放線菌門）含量隨時間段推移呈明顯上升趨勢，由出生時的3.4％上升至6個月時的45.7％。

9、
　　4.2嬰兒出生后隨時間段推移，屬水平上變化:生后第1天腸道菌群主要由Lactococcus（乳球菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）組成，第3天腸道菌群個體差異較大，有多種需氧菌及兼性厭氧菌定植，如Enterococcus(腸球菌屬)、Escherichia-Shigella（大腸埃希菌-志賀菌屬），且Lactococcus（乳球菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）急劇減少，第7天時雙歧桿菌定植增多，標本間差

10、異較大，生后1月時，所有標本都出現(xiàn)雙歧桿菌的定植，且迅速增長成為優(yōu)勢菌屬，平均達30％-40％，生后3個月時，各標本間菌群定植趨于相似，雙歧桿菌的定植更多，能達到40％-60％，主要有Bifidobacterium(雙歧桿菌)、Escherichia-Shigella（大腸埃希菌-志賀菌），生后6月時有的個體添加輔食后雙歧桿菌數(shù)量減少，未添加輔食的個體雙歧桿菌與3月時基本一致。
　　5、PCA分析顯示(1)組間相似性分析:A組與各

11、組存在明顯差異。其余各組無明顯聚集，各組微生物構(gòu)成差異較大。(2)所有個體相似性分析，可見A組菌群個體內(nèi)較相似，但與其他時間點差異較大，隨喂養(yǎng)時間的延長，腸道菌群發(fā)生改變。但是從個體角度分析，A組樣品相似度較高，B、C組個體相對集中，D組和E組個體間差異較大，F(xiàn)組個體又呈現(xiàn)菌群相似的趨勢。
　　6、變異分析:各組均出現(xiàn)變異個體，結(jié)合隨訪信息發(fā)現(xiàn)，母乳不足嬰兒以大腸桿菌定植為主，腹瀉嬰兒以大腸桿菌、梭菌屬等定植為主，應(yīng)用抗生素嬰兒出

12、新生兒期以葡萄球菌定植，以后持續(xù)大腸桿菌定植?？梢娢桂B(yǎng)方式、腹瀉、抗生素應(yīng)用對嬰兒腸道微生物定植的多樣性及結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生影響，為以后多因素分析提供依據(jù)。
　　結(jié)論:
　　1、Illumina Miseq測序平臺能夠測序腸道中所有微生物DNA序列，全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度，滿足對腸道微生物群落的全面認識。
　　2、足月健康、母乳喂養(yǎng)、陰道分娩兒腸道微生物區(qū)系:
　　2.1共測得17個門，占微生物區(qū)系99％有5

13、個門，分別為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭菌門。
　　2.2共測得181個屬，主要的屬大致有:雙歧桿菌屬、乳球菌屬、假單胞菌屬、腸球菌屬、大腸埃希菌-志賀菌屬、葡萄球菌屬、克雷伯氏菌屬、嗜冷桿菌屬等。
　　3、足月健康、母乳喂養(yǎng)、陰道分娩兒腸道微生物區(qū)系的演替:3.1在門水平上，出生時變形菌門及厚壁菌門是優(yōu)勢菌種，隨著時間的推移，變形菌門及厚壁菌門逐漸下降，放線菌門增長迅速，至6個月時為優(yōu)勢菌門。
　　3.