嬰兒生后糞便微生物區(qū)系的演變.pdf

1、目的:腸道微生物在營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫系統(tǒng)成熟以及促進(jìn)腸粘膜屏障的完善中起重要作用，腸道微生物群多樣性或結(jié)構(gòu)的改變與多種疾病有關(guān)，嬰兒時(shí)期是腸道微生物群定植、演替的重要階段，嬰兒時(shí)期腸道微生物群定植模式可持續(xù)至成年。以往對(duì)于腸道微生態(tài)的研究多采用培養(yǎng)或分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于腸道微生物群的多樣性研究有明顯的局限性，隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，以其測(cè)序快、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)逐漸應(yīng)用于腸道微生物的研究，這些研究大多在歐美國(guó)家完成，中國(guó)此方面文獻(xiàn)報(bào)道不

2、多，且樣本量少，結(jié)果差異性較大，不能全面體現(xiàn)嬰兒腸道微生物區(qū)系的定植及演變?nèi)^(guò)程。本研究旨在通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)嬰兒多個(gè)時(shí)間段的糞便微生物群進(jìn)行DNA測(cè)序，探討嬰兒生后糞便微生物區(qū)系的定植和演變過(guò)程，為今后腸道微生物群系變化與遠(yuǎn)期疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法:選擇2013年11月-2015年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院和石家莊市第四人民醫(yī)院出生的符合入組標(biāo)準(zhǔn)的新生兒30例，均為陰道分娩、母乳喂養(yǎng)

3、、家中成員無(wú)過(guò)敏史，母親圍產(chǎn)期未應(yīng)用抗生素，嬰兒及其雙親均生活在石家莊市或其周邊縣市，氣候環(huán)境，居住環(huán)境，飲食環(huán)境等相當(dāng)。收集其嬰兒出生后第1、3、7天，第1個(gè)月、3個(gè)月和第6個(gè)月齡時(shí)的糞便標(biāo)本（分別設(shè)定為A-F組），凍存于-80℃冰箱，并隨訪入組嬰兒上述時(shí)間段的喂養(yǎng)狀況、健康情況及用藥情況（抗生素及益生菌制劑）。采用OMEGA E.Z.N.A試劑盒提取糞便標(biāo)本中DNA，通過(guò)Illumina MiseqPE250高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌16

4、S rRNA的V3-V4可變區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用Mothur軟件對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行OTU聚類，分析腸道菌群的豐度及多樣性，在門及屬水平對(duì)嬰兒生后腸道微生物區(qū)系進(jìn)行詳細(xì)描述，并結(jié)合隨訪情況，分析出現(xiàn)變異原因。
　　結(jié)果:
　　1、入組嬰兒30例，收集其嬰兒出生后第1、3、7天，第1個(gè)月、3個(gè)月和第6個(gè)月齡時(shí)的糞便標(biāo)本，應(yīng)收集標(biāo)本180份標(biāo)本，但實(shí)際收集158個(gè)標(biāo)本，因各種原因脫落22個(gè)，脫落率為12％。其中15個(gè)糞便標(biāo)本提取DNA失

5、敗，11個(gè)標(biāo)本擴(kuò)增失敗，共計(jì)132個(gè)糞便標(biāo)本進(jìn)入測(cè)序程序，測(cè)得總序列5143376，總堿基數(shù)3096312352bp，經(jīng)過(guò)濾及篩選后，共獲得優(yōu)化序列為2717040，總堿基數(shù)為1206679948bp，平均長(zhǎng)度444.12bp。
　　2、對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與所代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線，此曲線趨于平坦，說(shuō)明所測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序深度足夠，能覆蓋腸道菌群97％的菌種。通過(guò)Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)隨著時(shí)間的推移

6、逐漸增大，顯示糞便微生物豐度逐漸增多，Shannon指數(shù)逐漸增大、Simpson指數(shù)逐漸減小提示生后隨時(shí)間推移，糞便樣本中菌群多樣性逐漸增加。
　　3、對(duì)132個(gè)糞便標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，共測(cè)得17個(gè)門，181個(gè)屬。其中在門水平上，占微生物區(qū)系99％的有5個(gè)門，分別為Proteobacteria（變形菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）Fusobacter

7、ia（梭菌門）。主要屬包括:Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Lactococcus(乳球菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Enterococcus(腸球菌屬)、Escherichia-Shigella（大腸埃希菌-志賀菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）Klebsiella（克雷伯氏菌屬）Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）等，共計(jì)181個(gè)屬。
　　4、嬰兒腸道微生物群定植及演變過(guò)程:<

8、br>　　4.1嬰兒出生后隨時(shí)間段推移，門水平上變化:Proteobacteria（變形菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）含量呈下降趨勢(shì)，Proteobacteria從出生第一天的46.5％，經(jīng)過(guò)6個(gè)月后下降至24％; Firmicutes從出生第一天的45.3％，經(jīng)過(guò)6個(gè)月后下降至23.3％。與之相反，嬰兒出生后Actinobacteria（放線菌門）含量隨時(shí)間段推移呈明顯上升趨勢(shì)，由出生時(shí)的3.4％上升至6個(gè)月時(shí)的45.7％。

9、
　　4.2嬰兒出生后隨時(shí)間段推移，屬水平上變化:生后第1天腸道菌群主要由Lactococcus（乳球菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）組成，第3天腸道菌群個(gè)體差異較大，有多種需氧菌及兼性厭氧菌定植，如Enterococcus(腸球菌屬)、Escherichia-Shigella（大腸埃希菌-志賀菌屬），且Lactococcus（乳球菌屬）和Pseudomonas（假單胞菌屬）急劇減少，第7天時(shí)雙歧桿菌定植增多，標(biāo)本間差

10、異較大，生后1月時(shí)，所有標(biāo)本都出現(xiàn)雙歧桿菌的定植，且迅速增長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌屬，平均達(dá)30％-40％，生后3個(gè)月時(shí)，各標(biāo)本間菌群定植趨于相似，雙歧桿菌的定植更多，能達(dá)到40％-60％，主要有Bifidobacterium(雙歧桿菌)、Escherichia-Shigella（大腸埃希菌-志賀菌），生后6月時(shí)有的個(gè)體添加輔食后雙歧桿菌數(shù)量減少，未添加輔食的個(gè)體雙歧桿菌與3月時(shí)基本一致。
　　5、PCA分析顯示(1)組間相似性分析:A組與各

11、組存在明顯差異。其余各組無(wú)明顯聚集，各組微生物構(gòu)成差異較大。(2)所有個(gè)體相似性分析，可見(jiàn)A組菌群個(gè)體內(nèi)較相似，但與其他時(shí)間點(diǎn)差異較大，隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，腸道菌群發(fā)生改變。但是從個(gè)體角度分析，A組樣品相似度較高，B、C組個(gè)體相對(duì)集中，D組和E組個(gè)體間差異較大，F(xiàn)組個(gè)體又呈現(xiàn)菌群相似的趨勢(shì)。
　　6、變異分析:各組均出現(xiàn)變異個(gè)體，結(jié)合隨訪信息發(fā)現(xiàn)，母乳不足嬰兒以大腸桿菌定植為主，腹瀉嬰兒以大腸桿菌、梭菌屬等定植為主，應(yīng)用抗生素嬰兒出

12、新生兒期以葡萄球菌定植，以后持續(xù)大腸桿菌定植。可見(jiàn)喂養(yǎng)方式、腹瀉、抗生素應(yīng)用對(duì)嬰兒腸道微生物定植的多樣性及結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生影響，為以后多因素分析提供依據(jù)。
　　結(jié)論:
　　1、Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)能夠測(cè)序腸道中所有微生物DNA序列，全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度，滿足對(duì)腸道微生物群落的全面認(rèn)識(shí)。
　　2、足月健康、母乳喂養(yǎng)、陰道分娩兒腸道微生物區(qū)系:
　　2.1共測(cè)得17個(gè)門，占微生物區(qū)系99％有5

13、個(gè)門，分別為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭菌門。
　　2.2共測(cè)得181個(gè)屬，主要的屬大致有:雙歧桿菌屬、乳球菌屬、假單胞菌屬、腸球菌屬、大腸埃希菌-志賀菌屬、葡萄球菌屬、克雷伯氏菌屬、嗜冷桿菌屬等。
　　3、足月健康、母乳喂養(yǎng)、陰道分娩兒腸道微生物區(qū)系的演替:3.1在門水平上，出生時(shí)變形菌門及厚壁菌門是優(yōu)勢(shì)菌種，隨著時(shí)間的推移，變形菌門及厚壁菌門逐漸下降，放線菌門增長(zhǎng)迅速，至6個(gè)月時(shí)為優(yōu)勢(shì)菌門。
　　3.