新型納米無(wú)定型磷酸鈣-聚乳酸復(fù)合材料聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力極為有限，由于創(chuàng)傷、腫瘤等原因引起的軟骨損傷很難自我修復(fù)，如果得不到有效的處理的話，往往會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性的關(guān)節(jié)退變和骨關(guān)節(jié)炎的形成。臨床上治療軟骨損傷的許多傳統(tǒng)方法，如微骨折、軟骨下鉆孔、骨膜和軟骨膜移植術(shù)等均存在一定的不足。近年來(lái)飛速發(fā)展的組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)帶來(lái)了新的思路。組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，對(duì)病損組織的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行再生和重建的一門(mén)新興學(xué)科，其中新型支架材料的研制開(kāi)發(fā)一直是組織工程的研

2、究熱點(diǎn)。本研究采用熱誘導(dǎo)相分離的方法制備出新型納米無(wú)定型磷酸鈣／聚乳酸(ACP／PLLA)三維多孔支架材料，并與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)相復(fù)合來(lái)探討它們?cè)陉P(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中的應(yīng)用前景。 第一部分:ACP／PLLA復(fù)合材料的制備和表征 目的：通過(guò)對(duì)新型ACP／PLLA復(fù)合材料表征來(lái)評(píng)價(jià)其作為軟骨組織工程支架材料的可行性。方法：采用熱誘導(dǎo)相分離的方法制備ACP／PLLA復(fù)合材料，對(duì)該復(fù)合材料的顯微形貌、孔徑、孔隙率和力

3、學(xué)性能進(jìn)行表征。觀察支架材料在浸泡PBS液后的形貌變化。同時(shí)將bFGF生長(zhǎng)因子復(fù)合在ACP／PLLA材料上，檢測(cè)bFGF在PBS溶液中的緩釋情況。結(jié)果：用熱誘導(dǎo)相分離方法制備的ACP／PLLA復(fù)合材料是一種三維多孔支架材料，材料孔徑在100—200gm之間，孔隙率為91％，材料彈性模量為3.46Mpa。當(dāng)材料浸泡在PBS液后，材料孔壁表面的ACP顆粒會(huì)發(fā)生形貌的變化，在原位轉(zhuǎn)變?yōu)槠瑺罴{米磷灰石晶體。當(dāng)bFGF復(fù)合在ACP／PLLA材料上

4、后，bFGF在溶液中能實(shí)現(xiàn)緩釋。結(jié)論：基于組織工程對(duì)支架材料的微觀要求，新型．ACP／PILA復(fù)合材料可望成為一種理想的軟骨組織工程支架材料，它可作為生長(zhǎng)因子的載體。 第二部分:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及與復(fù)合材料的生物相容性研究 目的：探索兔子骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bMSCs)的體外分離、培養(yǎng)方法，評(píng)價(jià)ACP／PLLA復(fù)合材料與bMSCs的生物相容性。方法：將抽取的兔子骨髓用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離bMSCs，在體

5、外進(jìn)行細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。將第三代的bMSCs種植在ACP／PLLA和PLLA材料上，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞在不同材料上的黏附和增殖情況，用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在材料中的生長(zhǎng)情況和形態(tài)改變。結(jié)果：分離獲得的bMSCs在3天左右貼壁，并逐漸變?yōu)樗笮?，?4天左右細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，而傳代后的細(xì)胞在7天左右就長(zhǎng)滿瓶底。將bMSCs接種至ACP/PLLA和PLLA材料后，細(xì)胞在ACP／PLLA復(fù)合材料上的黏附率為77

6、.8％，而在PLLA材料中的黏附率為51.1％，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在種植后第3天和第6天，ACP／PLLA材料組和平板培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于PLLA材料組(P<0.05)。之后，平板培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖速度明顯減慢，而材料組的細(xì)胞仍保持較高的細(xì)胞增殖速度，在培養(yǎng)的第10天，ACP/PLLA材料組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于PLLA材料組和平板培養(yǎng)組(P<0.05)。掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)在ACP／

7、PLLA材料組中bMSCs密度要明顯高于PLLA材料組。另外，掃描電鏡顯示bMSCs在．ACP/PLLA材料上黏附良好，并開(kāi)始分泌細(xì)胞外基質(zhì)，提示bMSCs在材料中具有良好的活力。結(jié)論：用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法可以分離并培養(yǎng)得到bMSCs。與PLLA材料相比，ACP／PLLA復(fù)合材料更能促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖，ACP/PLLA復(fù)合材料是_種更具優(yōu)勢(shì)的軟骨組織工程支架材料。 第三部分ACP／PLLA復(fù)合材料聯(lián)合bFGF在兔子骨軟骨

8、缺損修復(fù)中的應(yīng)用研究 目的：探索ACP／PLLA復(fù)合材料聯(lián)合bFGF生長(zhǎng)因子修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。方法：在21只骨骼發(fā)育成熟的兔子股骨內(nèi)髁制作直徑4mm，深5mm的骨軟骨缺損，在缺損處分別植入ACP／PLLA材料和bFGF的復(fù)合物、PLLA材料和bFGF的復(fù)合物或不做任何處理作為空白對(duì)照。在術(shù)后4周和12周取材，通過(guò)大體觀察和組織學(xué)切片觀察骨軟骨的修復(fù)情況，并對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行RT—PCR分析，檢測(cè)修復(fù)組織的基因表達(dá)情況。結(jié)果：

9、在術(shù)后4周時(shí)，ACP／PLLA／bFGF組和PLLA／bFGF組缺損內(nèi)均充滿一些不成熟的或纖維樣的修復(fù)組織，但沒(méi)有明顯的軟骨組織形成。在術(shù)后12周時(shí)，ACP／PLLA／bFGF組軟骨缺損表面覆蓋有一層典型的透明軟骨樣組織，在軟骨層下面也有一層連續(xù)的軟骨下骨形成。在PLLA／bFGF組中，修復(fù)組織主要為纖維軟骨組織，軟骨下骨形成不明顯。而空白對(duì)照組無(wú)論在4周還是12周缺損處凹陷明顯，表面只覆蓋有一薄層纖維組織，提示軟骨的自我修復(fù)能力很差。