膠原結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合膠原支架促進(jìn)坐骨神經(jīng)橫斷傷修復(fù)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 周圍神經(jīng)損傷(PNI)是當(dāng)今社會(huì)中一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題。它常常導(dǎo)致患者功能的喪失，影響患者的生活質(zhì)量。由于產(chǎn)傷、車禍或暴力傷等引起的周圍神經(jīng)損傷會(huì)導(dǎo)致感覺(jué)或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性壞死。盡管周圍神經(jīng)有再生的能力，但其功能恢復(fù)很不理想。根據(jù)神經(jīng)損傷的程度、嚴(yán)重性、缺損的長(zhǎng)度及軸突再生所需的時(shí)間的不同，功能的恢復(fù)程度也不同。在人類和哺乳動(dòng)物動(dòng)物，軸突的再生速度很慢（1或3毫米/天）。在臨床上，根據(jù)神經(jīng)纖維的損傷和神經(jīng)連續(xù)性

2、的喪失程度不同，周圍神經(jīng)損傷常分為3類:(1)神經(jīng)壓傷（有或無(wú)去髓鞘化）。(2)軸突斷傷（但神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜保留）。(3)神經(jīng)橫斷傷（神經(jīng)內(nèi)膜、束膜的連續(xù)性被破壞）。神經(jīng)損傷后軸突再生和髓鞘化可能對(duì)功能的恢復(fù)有幫助。
　　 人工神經(jīng)研究的不斷發(fā)展，有力地促進(jìn)了神經(jīng)軸突的再生和功能恢復(fù)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，人們?cè)诳山到饣虿豢山到獾纳窠?jīng)導(dǎo)管材料研究中取得了一些進(jìn)展。然而它們尚存在一定的局限性使得人們繼續(xù)探索更有效的策略以促進(jìn)周圍神經(jīng)

3、損傷再生。
　　 膠原材料在組織工程中是較好的材料之一。膠原材料因其低免疫原性和較好的可降解性而被廣泛應(yīng)用于組織再生。在本研究中，我們使用膠原導(dǎo)管來(lái)連接坐骨神經(jīng)近遠(yuǎn)兩斷端間的缺損，從而起到橋接作用，有序膠原材料(LOCS)填充于神經(jīng)導(dǎo)管中，共同組成神經(jīng)損傷修復(fù)膠原生物材料。前期的研究表明，神經(jīng)以不正確的方式生長(zhǎng)可能導(dǎo)致再生的神經(jīng)失去功能。我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究證實(shí)有序膠原材料(LOCS)是一種新型的神經(jīng)引導(dǎo)材料。除此之外，有序膠原

4、材料還可以被用來(lái)結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或作為攜帶藥物的載體。
　　 另一方面，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)因子對(duì)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)起重要作用。其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是一種重要的生長(zhǎng)因子，它能促進(jìn)軸突再生，對(duì)于施萬(wàn)細(xì)胞，體內(nèi)和體外的研究證實(shí)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能刺激施萬(wàn)細(xì)胞的增殖。然而，應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液體內(nèi)應(yīng)用后因?yàn)槠浒胨テ诙獭⒃隗w液沖刷后大量擴(kuò)散，因而并不能取得滿意的治療效果。為了在治療部位達(dá)到有效的藥物濃度，周期性注射用藥或大

5、劑量給藥是常用的方法。但這樣的方法會(huì)招致感染或嚴(yán)重的副作用。因此，我們將膠原結(jié)合區(qū)融合在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的一端從而構(gòu)建了CBD-bFGF。CBD-bFGF與膠原有較強(qiáng)的親和力，同時(shí)與bFGF有相同的生物活性。隨后，將CBD-bFGF與有序膠原材料特異結(jié)合以控制它的釋放速度。
　　 目的:在本研究中，我們將改造的CBD-bFGF、有序膠原材料和膠原導(dǎo)管聯(lián)合應(yīng)用從而構(gòu)建出一種天然的功能生物材料，隨后我們將此功能生物

6、材料用于大鼠坐骨神經(jīng)5毫米缺損的橫斷傷中，以促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　 方法：
　　 (1) CBD-bFGF和天然堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(NAT-bFGF)的制備。使用我們實(shí)驗(yàn)室之前的方法。將CBD-bFGF的基因序列用PCR擴(kuò)增出來(lái)并插入到pET-28a質(zhì)粒中。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)大腸桿菌中。隨后，用IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。用瓊脂糖鎳柱從上清中將目的蛋白純化出來(lái)。使用相同的方法將天然堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子構(gòu)建出

7、來(lái)。用Bradfod法測(cè)量蛋白的濃度。(2)有序膠原材料和膠原管的準(zhǔn)備。有序膠原材料來(lái)源于牛筋膜。膠原管來(lái)源于膠原膜。將膠原膜卷在模子上并交聯(lián)，將膠原管用NaH2PO4和蒸餾水洗干凈后凍干。將有序膠原材料切成5毫米長(zhǎng)，膠原管切成7毫米長(zhǎng)并輻照除菌。將CBD-bFGF、NAT-bFGF和PBS分別加在有序膠原材料上。(3)外周神經(jīng)損傷動(dòng)物模型制備。將所有的雄性大鼠分為3組，包括神經(jīng)缺損用膠原管和LOCS+CBD-bFGF連接（LOCS+C

8、BD-bFGF組）;神經(jīng)缺損用膠原管和LOCS+NAT-bFGF連接(LOCS+NAT-bFGF組);神經(jīng)缺損用膠原管和LOCS+PBS連接（LOCS+PBS組）。使用戊巴比妥鈉腹腔注射將大鼠麻醉。將大鼠右側(cè)的坐骨神經(jīng)暴露，剪去神經(jīng)干3毫米，由于神經(jīng)的回縮而造成5毫米的缺損。隨后將攜帶因子的有序膠原材料填充于膠原導(dǎo)管并用9/0的尼龍線將導(dǎo)管縫在神經(jīng)的兩斷端。在膠原管移植治療后的第六和第十二周用腹腔注射過(guò)量麻藥的方法將大鼠處死。(4)行走

9、足跡分析。使用Bain的方法計(jì)算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，記錄下白紙上大鼠腳印并通過(guò)公式計(jì)算SFI值。(5)電生理評(píng)價(jià)。在第十二周，大鼠被麻醉后，重新暴露出再生的坐骨神經(jīng)。將鉤狀的雙刺激電極放在神經(jīng)近端，兩刺激電極放在神經(jīng)的近遠(yuǎn)兩端，用電生理儀記錄神經(jīng)傳導(dǎo)速度。(6)熒光金逆行示蹤。在第十周將大鼠麻醉。重新暴露坐骨神經(jīng)，將熒光金注射在神經(jīng)的遠(yuǎn)端，分層縫合后將大鼠飼養(yǎng)兩周，在第十二周時(shí)處死。將大鼠L4到L6的背根神經(jīng)節(jié)取出做冰凍切片。在熒光顯微鏡

10、下計(jì)數(shù)發(fā)出金黃色熒光的感覺(jué)神經(jīng)元。(7)在第六和第十二周，取出大鼠新生神經(jīng)，固定后做石蠟切片。將切片用來(lái)做免疫組化。使用的一抗為NF和S-100，用軟件統(tǒng)計(jì)NF和S-100的陽(yáng)性面積比（陽(yáng)性面積/總面積）。一些切片被用來(lái)做堅(jiān)牢藍(lán)染色，統(tǒng)計(jì)新生神經(jīng)的數(shù)量和直徑，通過(guò)做透射電鏡來(lái)觀察髓鞘的厚度。一些新生神經(jīng)通過(guò)做HE染色來(lái)觀察軸突再生的有序結(jié)構(gòu)。(8)腓腸肌恢復(fù)率和馬松三色染色。我們測(cè)量了腓腸肌重量恢復(fù)率。大鼠被處死后雙側(cè)的腓腸肌被分離并在

11、電子天平上稱得濕重。通過(guò)患側(cè)肌肉重量與健側(cè)肌肉重量的比值測(cè)得腓腸肌恢復(fù)率。之后將腓腸肌做石蠟切片并做馬松三色染色。統(tǒng)計(jì)肌肉的陽(yáng)性面積比（肌肉面積/總面積）。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 文章中所使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為多樣本間多重比較中的S-N-K法。所使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS13.0。將統(tǒng)計(jì)后的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。將P值＜0.05或P＜0.01視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且在本文中的表達(dá)為*P＜0.05或**P＜0.0

12、1。
　　 結(jié)果：
　　 (1)神經(jīng)導(dǎo)管的概況。第十二周時(shí)，神經(jīng)缺口被有效地連接起來(lái)。膠原管被吸收了，被類似神經(jīng)的組織所代替。新生神經(jīng)與周圍組織間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的粘連。(2)行走足跡分析。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在-100到0之間，0代表正常神經(jīng)功能。-100代表神經(jīng)功能的完全喪失。在第四周前，三組之間沒(méi)有顯著性差異。從第五周開始，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在各組間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在LOCS+NAT-bFGF組的值要

13、高于LOCS+PBS組，但坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在LOCS+NAT-bFGF組的值要低于LOCS+CBD-bFGF組。(3)電生理學(xué)評(píng)價(jià)。我們發(fā)現(xiàn)在第12周各組的大鼠恢復(fù)到了不同的程度。神經(jīng)傳導(dǎo)速度在LOCS+CBD-bFGF組和LOCS+NAT-bFGF組要比LOCS+PBS組要快。同時(shí)神經(jīng)傳導(dǎo)速度在LOCS+CBD-bFGF組和LOCS+NAT-bFGF組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)熒光金逆行示蹤。在術(shù)后第12周。熒光金所標(biāo)記的背根神經(jīng)

14、節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元在紫外激發(fā)下呈現(xiàn)出金黃色。在各組將被標(biāo)記的感覺(jué)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示用LOCS+CBD-bFGF處理的組感覺(jué)神經(jīng)纖維的恢復(fù)要比LOCS+NAT-bFGF組和LOCS+PBS組好。被標(biāo)記的感覺(jué)神經(jīng)元的數(shù)量在LOCS+NAT-bFGF組要比LOCS+PBS組高。(5)組織和形態(tài)學(xué)分析。通過(guò)HE染色。我們發(fā)現(xiàn)在有序膠原材料的引導(dǎo)下，三個(gè)組（LOCS+CBD-bFGF組、LOCS+NAT-bFGF組、LOCS+PBS組）的神經(jīng)再

15、生均呈現(xiàn)出有序的結(jié)構(gòu)。為了評(píng)價(jià)新生神經(jīng)的再生軸突的數(shù)量和分布。在第6周和第12周，我們用NF一抗做了免疫組化。LOCS+CBD-bFGF組顯示了最好的軸突的恢復(fù)，而在LOCS+PBS組只顯示了稀少的NF的陽(yáng)性面積。各組間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S-100染色可以評(píng)價(jià)再生神經(jīng)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖情況，施萬(wàn)細(xì)胞的增殖對(duì)軸突的再生非常重要。定量分析顯示，在第6周和第12周，S-100的陽(yáng)性面積比在LOCS+CBD-bFGF組要高于LOCS+NAT-bF

16、GF組和LOCS+PBS組。而且與LOCS+PBS組相比，LOCS+NAT-bFGF組的陽(yáng)性面積比較高。(6)髓鞘分析。堅(jiān)牢藍(lán)染色后我們對(duì)再生神經(jīng)的數(shù)量和直徑進(jìn)行了分析。在第6周和第12周，再生神經(jīng)的數(shù)量和直徑從LOCS+PBS組到LOCS+NAT-bFGF組再到LOCS+CBD-bFGF組出現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，但是在第6周時(shí)，再生神經(jīng)的數(shù)量和直徑的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)透射電鏡，我們分析了髓鞘厚度。LOCS+NAT-bFGF組的厚度比LO

17、CS+PBS組高但比LOCS+CBD-bFGF組低。(7)肌肉重量檢測(cè)和馬松三色染色。與LOCS+NAT-bFGF組和LOCS+PBS組相比，LOCS+CBD-bFGF組的恢復(fù)率要比前兩組高。但是腓腸肌恢復(fù)率在LOCS+NAT-bFGF組和LOCS+PBS組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們分析了肌肉陽(yáng)性面積比例，LOCS+CBD-bFGF組、LOCS+NAT-bFGF組、LOCS+PBS組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肌肉陽(yáng)性面積比在正常肌肉最高，

18、在LOCS+PBS組最低。同時(shí)肌肉陽(yáng)性面積比在LOCS+CBD-bFGF組要高于LOCS+NAT-bFGF組。
　　 結(jié)論：
　　 在本研究中，膠原管、有序膠原材料和基因工程改造的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子被聯(lián)合應(yīng)用并構(gòu)建成一個(gè)生物功能材料，該功能材料各組分在大鼠坐骨神經(jīng)5毫米缺損的橫斷傷模型中起到了協(xié)同作用。與NAT-bFGF相比，由于CBD-bFGF能與膠原結(jié)合在治療部位形成了較高濃度，因此能更有效地促進(jìn)神經(jīng)再生和功能的