知母百合藥對的化學成分分析及藥動學研究.pdf

1、知母(RHIZOMA ANEMARRHENAE)和百合(BULBUS LILII)均為百合科植物，是我國民間常用的傳統(tǒng)中草藥，具有清熱除煩、瀉肺滋腎、養(yǎng)陰潤肺以及清心安神的功效。知母百合藥對由知母和百合兩味中藥組成，記載于東漢張仲景的《金匱要略》中,具有滋陰養(yǎng)肺，去火等臨床療效。本論文基于現代聯用分析技術，以知母和百合兩味中藥為研究對象，從體內外成分分析入手，建立了一套用于中藥體內外成分鑒別與藥效成分初步篩選的方法與模式，并將這些方法及

2、相關技術應用于中藥全面質量控制與體內多成分藥代動力學研究中。以知母百合藥對中皂苷類成分、雙苯吡酮類成分、蒽醌類成分和生物堿類成分為分析對象，運用HPLC-TOF/MS聯用分析技術對中藥體內外所含主要化學成分進行了分析鑒別，對主要化學成分的質譜碎裂規(guī)律進行了初步解析。
　　 一、知母藥材化學成分分析的研究
　　 第一，采用飛行時間質譜對知母藥材的化學成分進行定性鑒別與結構解析。得到的化合物精確分子量與建立的知母化學成分數據

3、庫做比對，鑒定出的21個化合物包括：18個皂苷類成分、3個雙苯吡酮類成分。分析確認了已知活性成分的結構，并獲取了它們的裂解規(guī)律。同時對其中一些未知成分進行了分析，通過與文獻的對照，推測了其中一些未知成分的結構。知母皂苷類成分化學結構的主要區(qū)別在于其結構母核上的連接基團的種類和數目不同，大多數知母皂苷類成分其結構母核上的連接基團為-O-nG，-CH3,-OH,-OCH3等，這使得皂苷類成分在碎裂電壓下裂解時，容易形成[M+H-n*162]

4、+, [M+H-15]+, [M+H-18]+,[M+H-31]+的碎片離子。如果在知母皂苷類成分結構母核的C-5和C-6 位置有一個雙鍵，C-3 位上連接有-OH基團，由于連接-OH的相鄰C 均為飽和烴形式，因此其很容易失去一分子水形成雙鍵。對于脫水后的雙鍵位置，從知母皂苷結構母核的共軛系統(tǒng)考慮，為保持結構母核的穩(wěn)定性，只可能在C-3和C-4 形成雙鍵。在知母皂苷類成分的裂解碎片中，出現的[M+H-15]+, [M+H-31]+，多是

5、由于從知母皂苷結構母核上失去-CH3,-OCH3中性碎片所得，根據結構母核的立體結構推斷，失去的-CH3，-OCH3 多是連接在C-15和C-22 位上。對于C-23 位有-OH的知母皂苷類成分，如知母皂苷F，在裂解時首先發(fā)生麥氏重排，如果在C-15 位含有-OH，進行麥氏重排后，會再脫去一分子水；C-22、C-23 鍵極不穩(wěn)定易進行α裂解。其它裂解方式跟知母皂苷類化學成分的裂解方式類似。
　　 第二，采用HPLC-DAD-MS

6、對知母藥材中兩種雙苯吡酮類成分和五種皂苷類成分進行含量測定。在系統(tǒng)考察了色譜質譜條件和樣品前處理方法的基礎上，建立了采用HPLC-DAD-MS 法同時測定知母中七個成分的含量測定方法；并對該方法進行了系統(tǒng)的方法學驗證，方法學驗證結果表明該含量測定方法可用于知母中七個成分的含量測定。將該方法應用于10個不同產地和批次的知母藥材中七個成分的含量測定。首次實現HPLC-DAD-MS 聯用一個系統(tǒng)對知母藥材中兩類具有不同檢測性質共七個成分的含量

7、測定。本文所建立的分析方法專屬、準確、靈敏、高效，為知母藥材的質量評價提供了新的方法。
　　 第三，應用單四級桿質譜同時對知母藥材中的七種有效成分做藥動學研究。采用液-液萃取法進行血漿樣品預處理，色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18(2.1×50mm,1.8μm)；流動相為0.1％ 甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫；采用正離子檢測方式，SIM 掃描模式。利用該法研究了SD大鼠灌胃給予知母提取液后七個主要成分的藥物動力學

8、行為。結果顯示，知母提取液中知母皂苷E1和E的T1/2、Cmax和Tmax等參數均小于知母提取液中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII、知母皂苷BIII、知母皂苷AIII。說明知母皂苷E1和E的吸收和代謝速度要快于知母提取液中的其他成分。灌胃給藥提取液后，知母中知母皂苷類成分的藥-時曲線成雙峰，這可能與腸肝循環(huán)有關。知母皂苷AIII的藥動學參數中Tmax明顯大于其它成分，顯示吸收和代謝慢于其它六個成分。知母提取液灌胃給藥后藥物動力學結果提示

9、，中藥提取物混合給藥的藥效作用時間延長，顯示中藥中化學成分協(xié)同配伍作用的內涵。
　　 二、百合藥材及知母百合藥對化學成分分析的研究
　　 第一，通過采用飛行時間質譜對百合藥材的成分進行定性鑒別與結構解析。
　　 得到的化合物精確分子量與建立的百合化學成分數據庫做比對，鑒定得到五個化合物：2個皂苷類、1個蒽醌類和2個生物堿類成分。分析確認了五個成分的結構，并獲取了它們的裂解規(guī)律。百合皂苷類成分化學結構的主要區(qū)別在于

10、其結構母核的不同，百合皂苷1其結構母核為替告皂苷元，而百合皂苷2的結構母核為薯蕷皂苷元。這使得百合皂苷類成分在進行高電壓裂解時，形成了不同的碎片離子。如果在百合皂苷類成分結構母核的C-5和C-6 位置有一個雙鍵，C-3 位上連接有-OH基團，由于連接-OH的相鄰C 均為飽和烴形式，因此其很容易失去一分子水形成雙鍵。對于脫水后的雙鍵位置，從百合結構母核的共軛系統(tǒng)考慮，為保持結構母核的穩(wěn)定性，只可能在C-3和C-4 形成雙鍵。在生物堿類成分

11、的裂解碎片中，出現的[M+H-28]+，[M+H-28-59]+，多是由于從結構母核上失去-CO和側鏈中性碎片所得，根據結構母核的立體結構推斷，失去的-CO和側鏈多是為了形成一個更徹底芳香化的結構。
　　 第二，通過采用飛行時間質譜對知母百合藥對的所有成分進行定性鑒別與結構解析。鑒定出的30個化合物包括：24個皂苷類成分、3個雙苯吡酮類成分、1個蒽醌類成分和2個生物堿類成分。闡述加入百合后對知母的物質基礎的影響，發(fā)現了4個新的知

12、母皂苷類成分：知母皂苷I、知母皂苷AI、知母皂苷G和知母皂苷D，并通過大量的特征碎片離子分析了其結構、獲取了裂解規(guī)律。發(fā)展建立了一個用于復雜中藥體系中的藥對及復方進行快速準確分析的研究方法與模式。
　　 大多數知母皂苷類成分其結構母核上C-15和C-22位上的連接基團為-O-nG，-CH3,-OH,-OCH3等，因而在進行高電壓裂解時，易形成[M+H-n*162]+, [M+H-15]+,[M+H-18]+, [M+H-31]+

13、的碎片離子。對于C-23位有-OH的知母皂苷類成分，在裂解時首先發(fā)生麥氏重排。其它裂解方式跟知母皂苷類化學成分的裂解方式類似。
　　 在百合皂苷類成分結構母核的C-5和C-6位置有一個雙鍵，C-3位上連接有-OH基團，由于連接-OH的相鄰C均為飽和烴形式，因此其很容易失去一分子水形成共軛雙鍵。蒽醌類成分的裂解是典型的C16、C20并合吡啶5-孕甾烯類化合物的裂解模式，主要是通過失去側鏈糖基和-CH3后產生特征碎片離子。
　

14、　 第三，應用單四級桿質譜同時對知母百合藥對中的七種成分做比較藥物動力學研究。合用百合后，根據知母皂苷類成分和雙苯吡酮類成分在大鼠體內藥動學參數進行組間t 檢驗的統(tǒng)計分析結果發(fā)現，五個知母皂苷類成分在大鼠體內的這些藥動學參數的差別具有顯著意義。知母百合藥對提取液的T1/2、Tmax、Cmax和AUC等參數均小于知母提取液，但CL/F值大于后者。這表明知母百合藥對中七個成分的吸收和代謝速度要快于知母提取液中的七個成分，兩者合用能夠提高皂

15、苷類成分和雙苯吡酮類成分的吸收。灌胃給藥提取液后，知母中知母皂苷類成分的藥-時曲線成雙峰，這可能與腸肝循環(huán)有關。關于知母和百合的藥動學研究很多，但是到目前為止沒有關于兩者配伍后對主要藥效成分體內吸收影響的文獻報道。
　　 本文研究結果表明，知母和百合的配伍改變了七個有效成分的某些藥動學參數，這種現象可能是由于百合的加入促進了皂苷類成分的吸收，從而影響了知母中有效成分的藥動學行為，知母百合藥對的配伍增效作用機制有待進一步深入研究。