MGMT基因在血小板特異性表達(dá)F9基因治療血友病B中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:在靶向血小板的血友病B基因治療中，慢病毒體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞經(jīng)骨髓移植進(jìn)入受體小鼠體內(nèi)。慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)還很難做到100％造血干細(xì)胞都有效轉(zhuǎn)入了目的基因，同時在骨髓移植中，雖然受體小鼠經(jīng)過輻照處理以清除自身的骨髓造血干細(xì)胞，但也不能保證100％的細(xì)胞清除率，而異體細(xì)胞與自身細(xì)胞相比總是會處于競爭的劣勢。因此在治療后小鼠體內(nèi)只有一部分造血干細(xì)胞成功地表達(dá)了目的基因，這將影響目的基因的表達(dá)水平和長期表達(dá)穩(wěn)定性。為提高目的基因的表達(dá)水平，幫助

2、移植的細(xì)胞在受體內(nèi)重建，本文研究內(nèi)容為探索通過藥物篩選基因MGMT(P140K)進(jìn)行體內(nèi)外藥物篩選的方法進(jìn)一步提高造血干細(xì)胞移植比例及FIX的表達(dá)水平。
　　方法:我們從人肝細(xì)胞中克隆了MGMT基因，以定點突變的方法將MGMT第140位的脯氨酸(ccc)突變?yōu)橘嚢彼?AAG)得到藥物篩選基因MGMT(P140K)，在2bF9-LV表達(dá)載體中插入藥物篩選基因MGMT(P140K)，構(gòu)建成含有MGMT(P140K)基因的FIX病毒載體

3、2bF9-LV(MGMT)。亞硝基類化療藥物卡氮芥(BCNU)和O6-BG合并處理造血干細(xì)胞，則只有轉(zhuǎn)移并表達(dá)了MGMT(P140K)基因的細(xì)胞可以存活下來，其他細(xì)胞將被殺死。通過體外和體內(nèi)實驗，利用MGMT(P140K)、BCNU和06-BG就可以實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的高效篩選。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了pWPT2bF9-MGMT(P140K)表達(dá)載體，并用這個載體制備了慢病毒載體2bF9-MGMT(P140K)-LV，同時也制備了一個

4、GFP慢病毒載體GFP-LV，慢病毒的滴度達(dá)到109拷貝/ml，GFP-LV在293T細(xì)胞和Dami細(xì)胞中高表達(dá)。以2bF9-MGMT(P140K)-LV感染Dami細(xì)胞，2bF9可表達(dá)產(chǎn)生FIX，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物篩選也初見成效。
　　結(jié)論:我們以慢病毒包裝體系成功地包裝生產(chǎn)了兩個病毒載體GFP-LV和2bF9-MGMT(P140K)-LV。通過GFP-LV在293T細(xì)胞和Dami細(xì)胞成功表達(dá)證明了慢病毒包裝體系可生產(chǎn)質(zhì)量可靠穩(wěn)