特異性殺傷EB病毒相關(guān)腫瘤的病毒基因治療的研究.pdf

1、該研究利用EBNA1與oriP的關(guān)系,以EBNA1作為靶基因,將oriP增強子片段與啟動子結(jié)合,插入到腺病毒復(fù)制關(guān)鍵基因E1區(qū)上游,從而使腺病毒復(fù)制只限在EBNA1陽性細胞中進行,而在EBNA1陰性細胞中不復(fù)制,以達到特異性殺傷EB病毒相關(guān)腫瘤的目的,為EB病毒相關(guān)腫瘤的治療提供新的方法.本研究包括以下三個方面:1.EBNA1陽性上皮細胞模型的建立:將1200bp的EBNA1基因片段插入真核細胞表達載體pcDNA3中,獲得質(zhì)粒pcDNA

2、3/EBNA1,用脂質(zhì)體介導(dǎo)將pcDNA3/EBNA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鼻咽癌CNE<,2>細胞和人宮頸癌Hela細胞,通過G418進行陽性克隆的篩選,PCR、RT-PCR和Western Blot進行鑒定,結(jié)果表明,兩種轉(zhuǎn)基因細胞株能夠表達EBNA1,為研究EB病毒相關(guān)腫瘤提供了良好的細胞模型.2.EB病毒復(fù)制起始區(qū)(oriP)對轉(zhuǎn)錄增強作用的研究:oriP是EB病毒染色體上一個1.7kb大小的區(qū)域,它維持了EB病毒質(zhì)粒在EBNA1陽性細胞中的

3、復(fù)制和穩(wěn)定存在,為了在EBNA1陽性細胞中篩選出oriP對轉(zhuǎn)錄最具增強作用的功能片段,利用PCR、酶切等技術(shù)獲得oriP不同的組合片段,插入到帶有CAT報告基因的載體pCAT3-Promoter中,構(gòu)建出一系列攜帶oriP不同功能片段的質(zhì)粒,并瞬時轉(zhuǎn)染EB病毒原型細胞株B95-8,培養(yǎng)48小時后,通過比較CAT的表達水平,得出在EB病毒基因組中位于7,394 bp~8,041 bp之間的FR片段對轉(zhuǎn)錄的增強作用最好,相當于oriP全序列