重組慢病毒載體介導造血干細胞途徑的血友病B基因治療研究.pdf

1、本研究采用重組慢病毒為載體，感染小鼠造血干細胞，然后將其移植到經同位素輻射破壞自身造血功能的NOD/SCID鼠中，以期提高hFIX在動物模型的表達水平和持續(xù)時間，為今后臨床試驗打下基礎?！　≡诒卷椦芯恐?，作者采用由Ubiquitin(泛素)啟動子調控的GFP(綠色熒光蛋白)基因和人凝血因子IX基因的重組慢病毒載體FUGW、FUXW。通過磷酸鈣三質粒共轉染的方法制備出高滴度的重組慢病毒?！　「腥綟UGW慢病毒的293T、Vero、He

2、la細胞72h后均可觀察到熒光。重組FUXW慢病毒通過尾靜脈注射入血友病B小鼠，表達最高峰值為30.7ng/mL,表達持續(xù)超過49天?！　》蛛x小鼠骨髓中單個有核細胞，體外培養(yǎng)并感染重組FUGW和FUXW慢病毒，一周后流式測得GFP陽性率12.1％，hFIX表達量為41.7±4.2ng/ml(ICR鼠)和34.5±6.5ng/ml(C57鼠)。通過免疫磁珠法(MACS)進一步分離小鼠造血干細胞lin-c-kit+，添加細胞因子短暫體外培

3、養(yǎng)并感染重組FUGW和FUXW慢病毒，一周后測得GFP陽性率為25.1％(加細胞因子)和16.6％(不加細胞因子)，hFIX表達量為46.6±5.7ng/ml(加細胞因子)和33.3±4.8ng/ml(不加細胞因子)?！　「腥局亟MFUGW和FUXW慢病毒的造血干細胞經尾靜脈移植到經60Co亞致死劑量輻射的NOD-SCID鼠中。前者移植后6-8周處死，分離外周、骨髓和脾臟細胞，觀察GFP在造血干細胞及其分化子代細胞中的表達；后者移植后一