多聚精氨酸-胞嘧啶脫氨酶融合蛋白抗腫瘤活性的研究.pdf

1、腫瘤嚴重威脅公眾健康，是世界范圍內威脅導致死亡的主要原因。雖然對于癌癥發(fā)生機理的研究已取得極大的進展，但若想徹底治療癌癥仍有很長的一段路要走。
　　 蛋白質等生物大分子在許多疾病的發(fā)生和治療中發(fā)揮著重要作用，但是根據(jù)類藥五規(guī)則[1]，通常認為蛋白質類藥物具有很差的滲透性。使得蛋白質這類有治療價值但無細胞膜穿透性且易降解的親水性分子在細胞生物學、藥學等研究領域中的應用大大受到限制。長久以來研究人員致力于探索將這些效應分子導入活細胞

2、的有效方法。常用的方法有:物理方法，如電穿孔[2]、顯微注射[3]等;生物及化學方法，如洋地黃皂苷處理法[4]、成孔蛋白質法[5]等;其他方法，如運用免疫毒素等蛋白質載體[6]、顆粒（如脂質體）包裹法[7]和病毒載體[8]等。盡管這些方法各有優(yōu)勢，但都存在分子導入率低、易造成細胞損傷甚至死亡、操作復雜和難于調控等問題。
　　 細胞穿膜肽(cell pnentrating peptides，CPPs)又稱蛋白轉導域(protein

3、 transductingdomain)、特洛伊肽(Trojan peptides)。通常含有5-30個氨基酸，與其他多肽不同的是，細胞穿膜肽可以通過無細胞特異性、受體介導自由地導入各種哺乳動物細胞內部，且不會造成細胞損傷。細胞穿膜肽的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來了曙光，在細胞生物學、藥物體內轉運、臨床藥效評價及細胞免疫學等研究領域均具有良好的應用前景。目前公認以細胞穿膜肽多聚精氨酸最為簡單有效。
　　 胞嘧啶脫氨酶(Cyt

4、osine Deaminase，CD)是自殺基因腫瘤治療中的典型代表。胞嘧啶脫氨酶可轉化無細胞毒性的前導藥物5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)為化療藥物5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。5氟尿嘧啶可通過抑制胸苷酸合成酶的活性阻斷DNA的復制繼而引起細胞凋亡。
　　 本研究所用胞嘧啶脫氨酶，為來源于大腸桿菌的原核胞嘧啶脫氨酶及其突變體。此突變體在天然的原核胞嘧啶脫氨酶的第316位苯丙氨酸和

5、第317為天冬氦酸突變?yōu)榘腚装彼岷透拾彼帷Ｍ蛔兒蟮脑税奏っ摪泵缚娠@著提高對5氟胞嘧啶的轉化效率，表現(xiàn)出更強的抑癌作用。
　　 本實驗在原pSUMO載體的基礎上構建pSUMO-R9-EGFP，將構建好的載體轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)，經IPTG誘導后通過SDS-PAGE比較SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP表達量及可溶性的差異。用Ni-NTA親和層析柱純化SUMO-R9-EGFP，并利用SUMOprotea

6、se I切去SUMO標簽，最終獲得純度較高的R9-EGFP成熟蛋白。以HepG2細胞為靶細胞，以EGFP為對照，利用流式細胞儀及激光共聚焦檢測R9-EGFP的穿膜效果，結果顯示獲得的成熟R9-EGFP可快速進入細胞內部，并聚集于細胞核內，而EGFP無此功能。同時R9-EGFP的穿膜效率呈時間、劑量依賴性，可被肝素抑制。
　　 在pSUMO-R9-EGFP質粒EGFP的位置插入原核胞嘧啶脫氨酶及其突變體，成功表達并純化多聚精氨酸-

7、原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體等融合蛋白。以HepG2細胞及U251細胞為靶細胞，以單獨原核胞嘧啶脫氨酶為對照，利用MTT比色法檢測兩種融合蛋白的細胞毒活性。結果顯示兩種融合蛋白均具有細胞毒性，且突變體優(yōu)于天然的原核胞嘧啶脫氨酶，單獨原核胞嘧啶脫氨酶無明顯細胞毒性，差異極顯著。
　　 以小鼠肝癌細胞H22為腫瘤動物模型，皮下注射多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脫氨酶突變體等融合蛋白，腹部