胞嘧啶脫氨酶APOBEC3G和APOBEC3F抗病毒調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、一些細(xì)胞內(nèi)的分子被發(fā)現(xiàn)是宿主抵抗病毒感染的第一道防線.胞嘧啶脫氨酶APOBEC家族的蛋白可以通過其脫氨酶活性導(dǎo)致病毒基因組DNA產(chǎn)生超突變或以一種未知的非編輯方式抑制病毒的復(fù)制.APOBEC3G(A3G)是該家族成員中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)具有抗HIV-1功能的蛋白.目前發(fā)現(xiàn)A3G具有廣譜的抗乙肝病毒(HBV),內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄病毒活性.APOBEC3F(A3F)也被發(fā)現(xiàn)具有類似的功能.它們可以被包裹進(jìn)HIV-1病毒顆粒,在新感染細(xì)胞中使逆轉(zhuǎn)錄

2、時(shí)合成的病毒cDNA上的脫氧胞嘧啶脫氨形成脫氧尿嘧啶從而導(dǎo)致病毒基因組上產(chǎn)生大量的G到A致死突變.除了該經(jīng)典的抗病毒模式,它們還可以通過一種非編輯突變的形式起到限制病毒復(fù)制作用.然而HIV-1的vif蛋白能通過CullinS-E3泛素化連接酶介導(dǎo)的蛋白酶體(proteasome)依賴途徑使A3G和A3F降解.因此宿主A3G/A3F和病毒vif的相互作用可以影響到HIV-1的發(fā)病過程.在病毒產(chǎn)生細(xì)胞中.A3G/A3F的量很大程度上決定了它

3、們?cè)谛赂腥炯?xì)胞中抗HIV-1的能力,故在體內(nèi)誘導(dǎo)A3G/A3F表達(dá)被認(rèn)為是一種有效的抗病毒策略. 一、α干擾素調(diào)控抗病毒因子APOBEC3G不依賴經(jīng)典STAT1信號(hào)通路但具有細(xì)胞類型依賴性干擾素常用于治療病毒感染疾病.經(jīng)典的IFN-α誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄途徑是通過STAT1:STAT2異源二聚體同干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)-9形成復(fù)合體,該復(fù)合體再結(jié)合到IFN應(yīng)答相關(guān)基因啟動(dòng)子的IFN刺激反應(yīng)元件(ISRE)上.IFN-γ途徑使用STAT1同

4、源二聚體直接結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)的IFN-γ刺激反應(yīng)元件上,并不需要IRF.本研究用qRT-PCR檢測了IFNs在不同細(xì)胞中誘導(dǎo)A3G表達(dá)的情況.這些細(xì)胞有原代細(xì)胞(肝細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和CIM<'+>T細(xì)胞)和細(xì)胞株(肝癌細(xì)胞,H9細(xì)胞和293T細(xì)胞).結(jié)果顯示IFN-α在H9和293T細(xì)胞中不能誘導(dǎo)A3G表達(dá),在原代肝細(xì)胞中IFN-α可以增加A3G表達(dá)24倍左右.在原代巨噬細(xì)胞IFN-α增加A3G表達(dá)為7倍左右.在肝癌細(xì)胞(HepG2,Hep

5、3B,Huh7)中IFN-α刺激增加A3GmRNA量在6到10倍.這表明IFN-α誘導(dǎo)A3G具有細(xì)胞類型依賴性.IFN-γ在肝細(xì)胞中也能誘導(dǎo)A3G表達(dá).為了研究A3G表達(dá)及IFN-α誘導(dǎo)A3G能力是否有個(gè)體差異,我們比較分析了四個(gè)供體(78,79,80和85)的對(duì)照原代肝細(xì)胞和IFN-α處理后這些細(xì)胞中A3G表達(dá)水平變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在未處理細(xì)胞中A3G的表達(dá)水平有些波動(dòng)(1到5倍),但是IFN處理后A3G表達(dá)水平變化在9到37倍.這表

6、明IFN-α誘導(dǎo)A3G具有明顯個(gè)體差異. 為了研究STAT1在IFN-γ誘導(dǎo)途徑中是否起作用,用基因特異的siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞下調(diào)STAT1和STAT2后,我們檢測了A3G和其它ISG基因還能否被IFN-γ誘導(dǎo).與預(yù)期一致,下調(diào)STAT1而不是STAT2有效的抑制了IFN-γ誘導(dǎo)A3G和對(duì)照基因IRF-1的表達(dá).因此,在Hep3B細(xì)胞中STAT1對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄途徑是必需的.為了驗(yàn)證我們發(fā)現(xiàn)的STA1非依賴的IF

7、N-α誘導(dǎo)基因表達(dá)途徑是否具有肝細(xì)胞特異性,我們檢測了293T細(xì)胞中STAT1是否為IFN-α誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄所必需.用對(duì)照,STAT1或STAT2siRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,再用IFN-α或IFN-γ刺激.結(jié)果在該細(xì)胞系中A3G不能被IFN-α或IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá),而其它被IFN-α誘導(dǎo)的ISG如ISG15,MX1和LMP2的表達(dá)均可以被STAT1和STA2siRNA特異的抑制.并且在293T細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)IRF-1和LMP2能被S

8、TAT1siRNA而不是STAT2siRNA特異的抑制.因此,與經(jīng)典的IFN信號(hào)途徑一致,STAT1在293T細(xì)胞中是IFN-α和IFN-γ誘導(dǎo)ISG必需的. 二、干擾素調(diào)控抗病毒因子APOBEC3F表達(dá)具有細(xì)胞類型依賴性 A3G和A3F可以共表達(dá)在許多組織和細(xì)胞中,如T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞等.通過對(duì)A3G和A3F基因上游序列分析,發(fā)現(xiàn)它們具有很高的同源性.提示A3G和A3F基因表達(dá)可能受相似的轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件所調(diào)控.用

9、qRT-PCR檢測IFN在原代肝細(xì)胞和多種肝細(xì)胞系中誘導(dǎo)A3F表達(dá)的情況.結(jié)果顯示同A3G相似,干擾素α、γ能誘導(dǎo)A3F表達(dá).在nepG2細(xì)胞中IFN-α誘導(dǎo)A3F表達(dá)4到12小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰.8到24小時(shí)內(nèi)IFN-γ誘導(dǎo)A3F表達(dá)達(dá)到高峰.在Hep3B細(xì)胞中IFN-α和IFN-γ也以一種劑量和時(shí)間相關(guān)的方式誘導(dǎo)A3F表達(dá).我們還檢測了幾個(gè)健康供體的原代肝細(xì)胞中IFN誘導(dǎo)A3F表達(dá)的情況.結(jié)果表明IFN-α誘導(dǎo)A3G的表達(dá)水平在不同個(gè)體間

10、有5到19倍的變化,IFN-α誘導(dǎo)A3F的表達(dá)不同個(gè)體間的差異在2到9倍左右.雖然在原代肝細(xì)胞中IFN-γ能有效的誘導(dǎo)IRF-1,但其在原代肝細(xì)胞中誘導(dǎo)A3F的能力比IFN-α低. 我們還檢測了IFN在原代CD<'+>T淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)A3F表達(dá)的情況.結(jié)果顯示16小時(shí)內(nèi)IFN-α和IFN-γ在一個(gè)供體的原代CD4<'+>T淋巴細(xì)胞中都不能誘導(dǎo).A3F的表達(dá).但在CD4<'+>T淋巴細(xì)胞中其它ISG,如PKR和IRF-1分別可以被

11、IFN-α和IFN-γ所誘導(dǎo).這表明在原代CD4<'+>淋巴細(xì)胞中IFN介導(dǎo)的信號(hào)途徑是有活性的.因此IFN誘導(dǎo)A3F轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能與誘導(dǎo)PKR和IRF-1途徑不同,其具有細(xì)胞類型依賴性.用qRT-PCR還檢測到A3F在巨噬細(xì)胞中能被IFN-α有效誘導(dǎo)表達(dá).在不同個(gè)體的原代巨噬細(xì)胞中IFN-α誘導(dǎo)A3F水平基本一致.IFN-γ誘導(dǎo)A3F表達(dá)的能力個(gè)體間存在較大差異.在一個(gè)個(gè)體的巨噬細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)A3F的能力同IFN-α基本一致,但在

12、其它個(gè)體中IFN-γ基本上沒有誘導(dǎo)A3F表達(dá). 三、抗病毒因子胞嘧啶脫氨酶APOBEC3G基因上游功能區(qū)域的鑒定 從NCBI數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn)A3G位于22號(hào)染色體的.APOBEC3基因簇上.A3G的基因長度為10.61Kb,包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子.翻譯起始位點(diǎn)位于第一個(gè)外顯子.所有內(nèi)含子以GT開始AG結(jié)束,符合典型的GT/AG規(guī)律.還發(fā)現(xiàn)Genbank中有多條A3CrmRNA序列,它們有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn).我們用5'R

13、ACE方法驗(yàn)證了A3G在一些細(xì)胞株和組織中是否存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn).結(jié)果發(fā)現(xiàn).A3G在胎盤組織中可能有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(-308和-40,ATG前一個(gè)堿基為-1).在外周血細(xì)胞中同樣鑒定出兩個(gè)可能的起始位點(diǎn)(-280和-97). 轉(zhuǎn)錄因子Egr-1,RXR-alpha 和Krox-20能結(jié)合-397/-358區(qū)域.在-82/-1區(qū)域則有ICSBP的結(jié)合位點(diǎn).在干擾素刺激實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)A3G基因上游-358/-223位置沒有IRS

14、E功能.在HepG2細(xì)胞中A3G基因的上游區(qū)域-5785/-2643,-3403/-1和基因內(nèi)-65/-H446區(qū)域也不對(duì)IFN-α刺激起反應(yīng).在Hep3B細(xì)胞中-1945/-1區(qū)域同樣不對(duì)IFN-α刺激起反應(yīng).因此,在HepG2和Hep3B細(xì)胞中A3G的IFN-α刺激反應(yīng)元件仍有待鑒定.在PMA刺激HepG2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PMA可以增強(qiáng)pGL2-A3G片斷的熒光素酶活性2倍左右.推測PMA能增強(qiáng)A3G啟動(dòng)子的活性. 本研究