MAD2、BUB1在自然流產(chǎn)染色體數(shù)目異常胚胎中的表達(dá).pdf

1、自然流產(chǎn)占全部妊娠的10％～15%,由遺傳、免疫、感染、解剖、內(nèi)分泌、環(huán)境等因素引起,遺傳因素中的染色體異常占所有自然流產(chǎn)的50%～60%。染色體異常分為數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常,約86%為數(shù)目異常,結(jié)構(gòu)異常僅6%,包括嵌合型在內(nèi)的其它異常占8%。
　　 染色體異?？赡茉从谂渥由汕暗挠薪z分裂、配子生成的減數(shù)分裂或受精卵最初幾次有絲分裂,是自然流產(chǎn)、出生缺陷的主要原因。人體的所有細(xì)胞均來(lái)源于兩個(gè)單倍體配子形成的受精卵,即:配子的染色體

2、異?？蓪?dǎo)致所有的子代細(xì)胞染色體出現(xiàn)異常;卵裂早期部分細(xì)胞出現(xiàn)染色體異常可導(dǎo)致嵌合型,而且發(fā)生越早,受影響的子細(xì)胞越多。因此,在配子生成、受精和卵裂過(guò)程中維持基因組的完整性對(duì)于人類(lèi)胚胎正常發(fā)育至關(guān)重要。
　　 單個(gè)受精卵發(fā)育成一個(gè)由多種細(xì)胞、組織和器官組成的個(gè)體是通過(guò)細(xì)胞增殖周期實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期分為G1、S、G2和M期(前、中、后和末期),是在多個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)的嚴(yán)格監(jiān)控下、由一系列連續(xù)事件按精確時(shí)間順序進(jìn)行的動(dòng)態(tài)過(guò)程,其中紡錘體組裝檢驗(yàn)

3、點(diǎn)(spindle assembly checkpoint,SAC)主要作用是監(jiān)控細(xì)胞分裂中期所有染色體與紡錘體微管正確連接并排列在細(xì)胞赤道面上,細(xì)胞方能進(jìn)入分裂后期,保證染色體能夠精確地分配到子細(xì)胞中,防止子細(xì)胞染色體出現(xiàn)數(shù)目異常,以維持基因組的完整性。
　　 MAD2、BUB1編碼的蛋白是SAC主要成份。MAD2作用是結(jié)合MAD1并被募集到動(dòng)粒,隨后發(fā)生構(gòu)象改變,轉(zhuǎn)變成C-MAD2后,與Cdc20、BUBR1、BUB3形成有

4、絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合物(mitotic checkpoint complex,MCC),MCC與后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex,APC/C)相互作用并抑制其泛素連接酶活性,使其不能靶向降解securin(人類(lèi)為hPTTG)和cyclin B,細(xì)胞不能進(jìn)入分裂后期,以提供時(shí)間改正不正確的動(dòng)粒.微管連接,防止染色體分離錯(cuò)誤。
　　 BUB1是結(jié)合BUB3的蛋白激酶,有三個(gè)主要區(qū)域:N末端保守區(qū)域作用

5、是定位動(dòng)粒;非保守區(qū)域作用是結(jié)合BUB3;C-末端區(qū)域作用是催化絲氨酸/蘇氨酸激酶。BUB1對(duì)于細(xì)胞分裂中期染色體中板集合是必須的,具體作用:建立并/或維持有效的紡錘體微管雙極連接;監(jiān)控微管連接到動(dòng)粒:募集MAD2、BUBR1和著絲粒相關(guān)蛋白CENP-E、CENP-F蛋白到動(dòng)粒;通過(guò)Shugoshin保護(hù)姐妹染色單體的Cohesion,防止姐妹染色單體過(guò)早分離。
　　 近年來(lái),SAC在染色體分離中的作用對(duì)于闡明胚胎染色體異常以及

6、在腫瘤生成中的作用成為細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn),但SAC在人類(lèi)早期胚胎發(fā)育及染色體異常中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用FISH技術(shù),選用13、16、18、21、22、X、Y染色體特異性探針,檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目是否異常,將自然流產(chǎn)胚胎分為染色體數(shù)目正常組和異常組,應(yīng)用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎組織MAD2、BUB1 mRNA及其蛋白的表達(dá),探討其在人類(lèi)胚胎染色體分離中的作用。
　　 目的：
　

7、　 通過(guò)檢測(cè)MAD2、BUB1 mRNA及其蛋白在自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目正常組、異常組中的表達(dá),探討其在人類(lèi)胚胎染色體分離中的作用。
　　 材料與方法：
　　 1研究對(duì)象
　　 病例來(lái)源于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2010年6月至2011年1月因先兆流產(chǎn)或超聲發(fā)現(xiàn)胚胎停育而就診的99例自然流產(chǎn)患者,應(yīng)用FISH技術(shù)將其分為染色體數(shù)目異常組和正常組。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1標(biāo)本采集與處理<

8、br>　　 清宮術(shù)后挑取絨毛組織,部分組織按照FISH檢測(cè)要求進(jìn)行標(biāo)本處理,其余絨毛組織迅速冷凍后置-80℃冰箱用于RT-PCR和Western-blot檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),留取標(biāo)本時(shí),均征求患者同意并簽署知情同意書(shū)。
　　 2.2 FISH檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織染色體數(shù)目
　　 2.2.1標(biāo)本處理
　　 無(wú)菌挑選自然流產(chǎn)胚胎新鮮絨毛組織5～10mg,生理鹽水沖凈血液和粘液,眼科

9、剪剪碎后低滲,固定,冰醋酸消化,離心后棄上清液,滴片。
　　 2.2.2 FISH檢測(cè)
　　 滴好的標(biāo)本片經(jīng)胃蛋白酶消化后置74.5℃變性液5mn,-20℃預(yù)冷乙醇梯度脫水,將10μl探針加于標(biāo)本片雜交區(qū)域,封片后置濕盒42℃恒溫培養(yǎng)箱中雜交過(guò)夜。暗室中將標(biāo)本片依次置預(yù)熱的50%甲酰胺/2×SSC溶液、2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,經(jīng)70%乙醇脫水,自然干燥后滴加10μlDAPI復(fù)染劑,熒光顯

10、微鏡下觀察結(jié)果。
　　 2.3 RT-PCR檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織MAD2、BUB1 mRNA的表達(dá)
　　 引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取胚胎絨毛組織總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)后,采用凝膠成像儀掃描,結(jié)果取目的基因與β-actin基因灰度值的比值,作為MAD2、BUB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　 2.4 Western-b

11、lot檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織MAD2,BUB1蛋白的表達(dá)
　　 RIPA裂解法提取組織總蛋白,BCA法測(cè)定提取的蛋白質(zhì)總濃度。Western-blot檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎絨毛MAD2、BUB1蛋白的表達(dá),以目的蛋白與β-actin蛋白相對(duì)灰度比值代表被測(cè)基因蛋白相對(duì)表達(dá)量。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,兩組間孕婦孕周的比較采用校正t檢驗(yàn),兩組間孕婦年齡、孕次、自然流產(chǎn)次數(shù)采用

12、Mann-Whitney U檢驗(yàn),孕周與胚胎染色體異常率比較采用校正x2檢驗(yàn),自然流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常率采用Kruskal Wallis檢驗(yàn),計(jì)量數(shù)據(jù)以-x±s表示,兩組問(wèn)MAD2,BUB1表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn),以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1一般資料
　　 99例自然流產(chǎn)患者年齡21～41歲,孕周6～16周,孕次1～9次,自然流產(chǎn)次數(shù)1～4。應(yīng)用FISH技術(shù)將自然流產(chǎn)胚胎分為染色體數(shù)目異

13、常組(49例)和正常組(50例)。染色體數(shù)目異常組孕婦孕周(10.3±2.0)、年齡(30.04±4.9歲)、孕次(2.7±1.7)以及流產(chǎn)次數(shù)(1.44±0.6)與正常組孕婦孕周(10.24±2.5)、年齡(28.2±4.4歲)、孕次(2.1±1.2)以及流產(chǎn)次數(shù)(1.44±0.6)相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.101,P=0.92;Z=-1.881,P=0.06;Z=-1.852,P=0.06;Z=-0.226,P=0.82)。

14、r>　　 2自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織中MAD2、BUB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量
　　 異常組胚胎絨毛組織中MAD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.894±0.19,明顯高于正常組的0.79±0.21(t=-2.317,P=0.023);異常組胚胎絨毛組織中BUB1mRNA相對(duì)表達(dá)量(1.04±0.23)高于正常組(0.97±0.25),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.333,P=0.186)。
　　 3自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織中MAD2

15、、BUB1蛋白相對(duì)表達(dá)量
　　 異常組胚胎絨毛組織中MAD2蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.46±0.06,明顯高于正常組的0.42±0.08(t=-2.373,P=0.020);異常組胚胎絨毛組織中BUB1蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.354±0.05)高于正常組(0.334±0.07),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.510,P=0.134)。
　　 結(jié)論：
　　 MAD2在胚胎染色體數(shù)目異常組中高表達(dá),延長(zhǎng)了SAC的有絲分裂阻滯持