美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的多樣性研究.pdf

1、在細菌耐藥日趨嚴重的今天，加強新藥研發(fā)具有非常重要的現(xiàn)實意義。放線菌是新型抗菌藥物的重要來源。長期以來，研究放線菌天然藥物的重點多集中在土壤放線菌。但是，隨著土壤放線菌資源開發(fā)利用日趨達到極限，從中發(fā)現(xiàn)新藥物或先導化合物的幾率大大降低，分離的活性代謝產(chǎn)物95％以上都是已知化合物。因此，拓寬放線菌研究領(lǐng)域，從不同來源的生物中尋找新的放線菌資源，是必由之路。自上世紀60年代起，海洋微生物和中藥植物內(nèi)生菌逐漸成為新藥研發(fā)的熱點。迄今為止，已從

2、中發(fā)現(xiàn)了近兩萬種天然產(chǎn)物，而有關(guān)昆蟲微生物天然產(chǎn)物的研究只見零星報道。昆蟲是自然界最大的生物種群，約占全物種的85%以上，生命力非常頑強，大量內(nèi)生菌與昆蟲互惠共生、協(xié)同進化、抵抗致病菌入侵。美洲大蠊是傳統(tǒng)中藥材，具有抗菌、抗腫瘤、提高免疫力、保肝、促進組織修復及抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。美洲大蠊存在地球2億多年，仍生生不息，現(xiàn)已成為室內(nèi)的優(yōu)勢種群，主要生活在廚房、廁所、浴室及下水道等陰暗潮濕的環(huán)境。現(xiàn)代醫(yī)學對美洲大蠊藥理作用的研究越來越多，但有

3、關(guān)美洲大蠊內(nèi)生放線菌多樣性及其應用方面的研究還較少。本文擬系統(tǒng)研究美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的多樣性，為充分認識其藥用價值和生物特性奠定基礎。
　　研究目的:
　　以野生美洲大蠊為研究對象，分離其腸道內(nèi)生放線菌。采用形態(tài)學和分子生物學等方法進行初步分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學分析，并對從美洲大蠊腸道分離得到的13株內(nèi)生戈登氏放線菌的生理生化特性進行了初步研究。通過對美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌生物多樣性的研究，期望為新藥研發(fā)提供新的微生物資源

4、。
　　研究方法:
　　1.美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的分離鑒定:
　　選擇適宜的抑菌劑，采用平板劃線稀釋法分離美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌。通過形態(tài)觀察、16S rDNA擴增產(chǎn)物Blast序列比對和DNAman6.0序列比對進行初步的分類鑒定，運用Mega5.1軟件，采用最大似然值法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對其進行分析。
　　2.13株內(nèi)生戈登氏放線菌的生理生化特性研究
　　通過形態(tài)觀察、16S rDNA擴增產(chǎn)物Blast

5、序列比對和DNAman6.0序列比對13株戈登氏放線進行分類鑒定，運用Mega5.1軟件，采用最大似然值法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對其進行分析。運用GenBank中的BankIt軟件，申請13株戈登氏放線菌基因序列號。在此基礎上，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)、大腸埃希

6、菌(Escherichia coli,E.coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumonica)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）等5種細菌和白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)、黑曲霉（Aspergillus nige,A.nige）、紅色毛癬菌(

7、Trichophyton rubrum,T.rubrum)等4種真菌為供試菌，檢測13株內(nèi)生戈登氏放線菌發(fā)酵液的初步抑菌活性。并通過碳源利用實驗、纖維素降解實驗、淀粉降解實驗、生物大分子降解實驗、殺蟲劑主要活性成分降解實驗和重金屬離子吸附實驗等研究其理化性質(zhì)。
　　實驗結(jié)果：
　　1.從13只美洲大蠊腸道中共分離得到了159株內(nèi)生放線菌，形態(tài)特征符合放線菌的經(jīng)典特征。16S rDNA擴增產(chǎn)物Blast序列比對結(jié)果顯示，159

8、株內(nèi)生放線菌分屬10個科，12個屬，其中鏈霉菌屬和戈登氏放線菌屬是優(yōu)勢菌屬，分別占分離總數(shù)的67.3%、8.2%。DNAman6.0序列比對結(jié)果顯示，149株放線菌與已知放線菌的相似度低于98.2%，占總分離菌株數(shù)的93.7%，可能是新菌株。
　　2.DNAman6.0序列比對結(jié)果顯示13株內(nèi)生戈登氏放線菌與已知菌株的相似性均低于98.2%，可能為新的菌種。經(jīng)申請，共有8株戈登氏放線菌的基因序列號。生理生化特性實驗結(jié)果顯示，有4株

9、戈登氏放線菌的發(fā)酵液對S.aureus有抑制作用，4株對MRSA有抑制作用，4株對E.coli有抑制作用，8株對B.subtilis有抑制作用；3株對C.albicans有抑制作用，2株對T.rubrum有抑制作用，對K.pneumonica和A.fumigatus有抑制作用的只有1株，沒有發(fā)現(xiàn)對A.nige有抑制作用的菌株；13株戈登氏放線菌均能吸收利用葡萄糖和蔗糖，均不能吸收果糖和甘露糖，部分能吸收木糖、肌醇和鼠李糖；13株內(nèi)生戈登