膠體金免疫層析法快速定量檢測動物組織中喹乙醇的研究.pdf

1、喹乙醇(Olaquindox)是化學合成的喹噁啉類廣譜抗菌藥物，作為飼料添加劑可顯著促進動物生長，并可預防和治療細菌感染性疾病。但研究發(fā)現(xiàn)，喹乙醇具有中等以上的蓄積毒性，使用不當會導致動物畸變，癌變甚至死亡，且殘留在動物組織中的喹乙醇對人體健康也有很大的威脅。目前，動物組織中喹乙醇殘留檢測方法主要是色譜法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)，但這些方法對操作人員要求較高，耗費時間較長，不易普及。隨著膠體金免疫層析技術（gold immune ch

2、romatographic assay，GICA）快速診斷試紙條（簡稱膠體金試紙條）的發(fā)展，其因具有檢測簡便快捷、無需檢測儀器，且成本低、無污染等優(yōu)點，已逐漸被應用于食品農(nóng)獸藥殘留的監(jiān)測中。本試驗旨在應用膠體金免疫層析技術建立動物組織中喹乙醇殘留的快速定量檢測方法。
　　1.喹乙醇多克隆抗體的制備和鑒定。為制備喹乙醇多克隆抗體，采用琥珀酸酐法合成半抗原喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS)，通過活化酯法將半抗原與載體蛋白(BSA和OVA

3、)偶聯(lián)制備喹乙醇免疫原(OLA-HS-BSA)和包被原(OLA-HS-OVA)，利用紫外分光光度法測定其濃度并掃描鑒定;利用制備的免疫原對6周齡BALB/c小鼠免疫以制備多克隆抗體，ELISA法測定多抗血清效價，鑒定抗體敏感性和特異性。結果顯示，OLA-HS和BSA，OVA的分子結合比分別為6∶1和6∶1，血清效價達到1∶51200，檢測抗體IC50值為17.4ng/mL，IC20值為3.86ng/mL，與卡巴氧的交叉率為0.53％，與

4、乙酰甲喹，3-甲基-喹噁啉-2-羥酸等藥物幾乎不存在交叉反應。
　　2.喹乙醇膠體金免疫層析試紙條的制備。將已制備純化好的喹乙醇多克隆抗體與膠體金結合產(chǎn)生的金標抗體噴涂在玻璃纖維墊上，并將包被抗原OLA-OVA和羊抗鼠二抗分別結合在硝酸纖維素膜上，組裝成免疫層析快速檢測試紙條，并檢測試紙條的靈敏度、特異性、準確性和穩(wěn)定性。將制備的試紙條用于檢測豬肉和豬肝樣品，結果表明本研究制備的試紙條可以在5 min內(nèi)完成檢測，肉眼觀察的最低檢測

5、限為0.05μg/mL，與其結構類似物卡巴氧、乙酰甲喹、3-甲基-喹噁啉-2-羥酸的反應交叉性小，該試紙條假陽性率小于5％，假陰性率為0，在干燥常溫條件下保存6個月仍然有效。因此，本試驗研究的檢測方法可應用于動物組織中喹乙醇的快速檢測和現(xiàn)場篩查。
　　3.喹乙醇膠體金免疫層析試紙條定量檢測喹乙醇的殘留量和市場應用。在膠體金免疫層析基礎上建立了T/C比值法定量檢測動物組織中喹乙醇殘留，檢測結果與ELISA和高效液相色譜法(HPLC)

6、相比較。當組織中喹乙醇質(zhì)量濃度在1～200ng/mL范圍內(nèi)，試紙條有較好的線性關系，最低檢測限為6.83ng/mL。陰性加標試驗結果表明，喹乙醇濃度在25，50和100ng/mL時，試紙條的回收率在90.9～105.0％之間，與采用用ELISA法和HPLC法的檢測結果較一致。
　　總之，本研究所研制的喹乙醇膠體金試紙條具有特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏度高等特點，在實際動物組織樣品的喹乙醇殘留檢測中所得到的檢測結果與ELISA法和HPL