狂犬病的探索治療以及相關(guān)病毒在神經(jīng)科學中的應用.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)感染動物神經(jīng)系統(tǒng)導致神經(jīng)活動紊亂的一種人畜共患病，致死率高達100％。狂犬病在全球范圍內(nèi)分布廣泛，當前對狂犬病的防控仍不徹底，每年依然有上萬例狂犬病患者死亡。目前針對狂犬病防控和治療的研究主要集中在RABV的疫苗研發(fā)、田間防疫、發(fā)病機理以及藥物控制等方面，但對狂犬病的治療仍然沒有有效的藥物和方法。由于狂犬病病毒侵染神經(jīng)系統(tǒng)導致神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂，短時間內(nèi)嚴重威脅患者的生命，為了緩

2、解狂犬病毒引起的神經(jīng)紊亂并為機體免疫系統(tǒng)贏得抵抗狂犬病病毒的寶貴時間，我們利用目前對神經(jīng)具有保護作用的藥物-美金胺(memantine)來開展該藥物在緩解狂犬病癥狀方面的研究，以期為狂犬病的臨床治療提供新的思路和方法。
　　另一方面，由于RABV對神經(jīng)系統(tǒng)的高度嗜性，是目前最為常用的高效逆行環(huán)路示蹤病毒之一?；赗ABV開發(fā)更為有效的環(huán)路示蹤工具將有助于神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)與功能的研究。因此，我們在已有的RABV反向遺傳學系統(tǒng)的基礎(chǔ)上對病

3、毒基因組做出改造和修飾，拯救出了有標記和操控功能的且傳播缺陷的糖蛋白缺失重組病毒(rRABV△G)，并且用于解析視覺神經(jīng)環(huán)路的精細結(jié)構(gòu)和功能。
　　具體研究內(nèi)容如下:
　　1.Memantine緩解狂犬病癥狀的研究
　　藥物memantine能夠通過血腦屏障，對神經(jīng)元表面N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA受體)非競爭性可逆結(jié)合，對神經(jīng)元具有保護作用，

4、用于治療阿爾茨海默癥。為了探索該藥物能否緩解狂犬病毒造成的神經(jīng)活動紊亂，我們開展了如下實驗:(1)將RABV中強毒株CVS-24感染體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元，加入memantine后發(fā)現(xiàn)其對RABV引起的神經(jīng)元損傷有一定的保護作用;(2)在小鼠的RABV攻毒實驗中，memantine對發(fā)病小鼠的治療作用有限，能微弱地延長發(fā)病小鼠生存時間。作為對比，在日本乙型腦炎病毒(JapaneseEncephalitis Virus，JEV)感染的小鼠實

5、驗中，memantine能顯著延長小鼠生存時間、降低腦內(nèi)血管袖套和炎性細胞浸潤，對小鼠腦內(nèi)病毒量也有降低作用。
　　2.利用狂犬示蹤病毒(rRABVAG)解析初級視覺皮層至丘腦環(huán)路的精細結(jié)構(gòu)
　　通過反向遺傳學操作系統(tǒng)改造rRABV-SAD，敲除糖蛋白(glycoprotein，G)基因并插入多種顏色的熒光蛋白基因，得到多色狂犬示蹤病毒。將該病毒注射到小鼠丘腦背外側(cè)核（lateraldorsal of thalamus nu

6、cleus，LD）、丘腦后外側(cè)核(lateralposteriorof thalamus nudleus，LP)和外側(cè)膝狀體背側(cè)核(dorsal part of lateral geniculate nucleus，dLGN)等初級視覺皮層(primary cisual cortex，V1)的投射靶區(qū)，逆行標記靶向該區(qū)的V1皮層神經(jīng)元，通過熒光顏色將靶向丘腦特定核團的V1神經(jīng)元分群，并分析了它們的分布特點;同時我們觀察到一些同時投射到丘

7、腦的多個核團的V1皮層神經(jīng)元即多靶神經(jīng)元，進一步結(jié)合熒光顯微光學切片斷層成像技術(shù)(fluorescencemicro-optical sectioning tomography，fMOST)，我們對單細胞水平的V1皮層多靶神經(jīng)元進行了全腦精細成像;為了進一步追蹤靶向丘腦特點核團的V1神經(jīng)元的上游環(huán)路，我們在V1皮層感染AAV病毒補充狂犬病毒的G蛋白，使V1神經(jīng)元內(nèi)的rRABV△G逆行跨單級突觸標記上游神經(jīng)元，從而解析了V1-LD、V1-

8、LP和V1-dLGN環(huán)路的上游環(huán)路，進而對上游神經(jīng)元的分布和數(shù)量進行全腦范圍內(nèi)統(tǒng)計分析，最終得到全面而詳細的V1至丘腦環(huán)路的精細結(jié)構(gòu)。
　　3.利用改造的嗜神經(jīng)病毒初步探索V1至丘腦環(huán)路的功能
　　結(jié)合rRABV△G病毒示蹤技術(shù)和在體雙光子鈣成像技術(shù)，我們對V1-丘腦核團的環(huán)路進行功能上的探索，主要在樹突棘和樹突水平分析了靶向丘腦不同核團的V1神經(jīng)元的自發(fā)神經(jīng)活動特點，從而對比V1-丘腦特定核團投射環(huán)路中V1神經(jīng)元接收上游環(huán)

9、路的輸入的差異。
　　4.單眼視覺剝奪的病理模型中V1至丘腦環(huán)路的結(jié)構(gòu)可塑性
　　在單眼視覺剝奪(monocular deprivation，MD)模型下，結(jié)合rRABV△G病毒示蹤、光遺傳學和在體光纖記錄手段探索V1-丘腦環(huán)路的可塑性。通過rRABV△G-eGFP病毒對MD小鼠對側(cè)丘腦核團逆行標記，發(fā)現(xiàn)逆標的V1神經(jīng)元數(shù)量與對照相比顯著減少，提示在視覺形成關(guān)鍵期對小鼠單眼視覺剝奪能夠引起V1-丘腦投射的減少;進一步通過光遺