癌胚抗原及甲胎蛋白與游離絨毛膜促性腺激素雙標記磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑的研制.pdf

1、本研究主要是利用磁珠作為包被抗體的固相載體并結合時間分辨熒光免疫分析技術，采用雙抗體夾心法研制出磁珠時間分辨檢測CEA的單標記熒光免疫分析試劑和同時檢測AFP及Freeβ-hCG的雙標記熒光免疫分析試劑。本課題實驗內(nèi)容主要分為三大部分:1）、用不同粒徑、不同化學基團修飾的磁珠連接抗體，選取合適的磁珠作為固相載體并且優(yōu)化連接工藝和鑭系稀土元素螯合物標記抗體;2）、反應體系的建立和優(yōu)化，并通過優(yōu)化的反應體系對試劑盒的各項性能指標作出全面而整

2、體的分析，包括:準確性、靈敏度、特異性、精密度、抗干擾性分析、穩(wěn)定性;3）、用自制試劑盒與國外同類的診斷試劑進行比較，評價其初步應用于臨床檢測的可行性。
　　研究結果一顯示，自制的CEA磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下，經(jīng)測定本試劑分析靈敏度為0.5 ng/mL，將抗原稀釋成不同濃度進行測定，測得標準曲線線性范圍為1～1000 ng/mL。用本研發(fā)試劑對三個不同濃度自制的CEA質(zhì)控品進行檢測，結果本試劑的分析內(nèi)變異系數(shù)(C

3、V％)為2.722％～3.252％和分析間變異系數(shù)(CV％)為3.157％～3.765％?；厥章蕦嶒灲Y果為90.1％～99.2％，符合試劑盒要求。將高濃度的AFP、CA125、癌抗原19-9(CA19-9)及人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)當作樣品用本試劑測定，結果表明無明顯交叉反應。檢測質(zhì)控樣本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天或4℃1年，各項性能指標均符合要求，穩(wěn)定性較好。用

4、自制的試劑分別與PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒和雅培公司的化學發(fā)光試劑盒同時對239份血清樣本進行檢測。以自制試劑測定血樣的CEA濃度結果為橫坐標，以PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA測定的濃度結果為縱坐標做回歸分析，相關方程為:Y=1.049X+1.696，相關系數(shù)R2=0.970，P＜0.001。以自制試劑測定血樣的CEA濃度結果為橫坐標，以雅培公司化學發(fā)光測定的CEA濃度結

5、果為縱坐標做回歸分析，相關方程為:Y=0.873X-3.802，相關系數(shù)R2=0.951，P＜0.001。經(jīng)統(tǒng)計學處理結果表明，本方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA和羅氏電化學發(fā)光試劑盒臨床血樣測值均具有顯著相關性。
　　研究結果二顯示，自制的AFP及Freeβ-hCG雙標記磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑在優(yōu)化的條件下，經(jīng)測定本試劑AFP分析靈敏度和標準曲線線性范圍分別為0.05 ng/mL和0.1～7

6、50 ng/mL，F(xiàn)reeβ-HCG分析靈敏度和標準曲線線性范圍分別為0.08 ng/mL和0.16～450 ng/mL。用本自制試劑對AFP及Freeβ-hCG質(zhì)控品進行檢測，結果AFP的分析內(nèi)變異系數(shù)為2.6％～5.1％和分析間變異系數(shù)為1.9％～5.1％，F(xiàn)ree-β-HCG的分析內(nèi)變異系數(shù)為4.1％～4.7％和分析間變異系數(shù)為4.7％～5.0％。回收率實驗96.0％～106.0％，符合試劑盒要求。將高濃度的CEA、CA125、C

7、A15-3、CA19-9、LH、FSH、TSH及hCG當作樣品用本試劑測定，結果表明無明顯交叉反應。檢測質(zhì)控樣本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天或4℃1年，各項性能指標均符合要求，穩(wěn)定性較好。用自制的試劑和PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒同時對444份孕中期血清樣本進行檢測。以自制試劑盒測定血樣的濃度結果為橫坐標，以PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試

8、劑盒測定的濃度結果為縱坐標做回歸分析，AFP相關方程為:Y=0.961X+1.554，相關系數(shù)R2=0.970，P＜0.001;Freeβ-hCG相關方程為:Y=1.044X-1.421，相關系數(shù)R2=0.966，P＜0.001。經(jīng)統(tǒng)計學處理結果表明，本發(fā)明方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒具有顯著相關性。
　　綜上所述，本論文一方面初步闡明了本研究研制的CEA磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑、AF

9、P及Freeβ-hCG雙標記磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑的各項指標（準確性、靈敏度、精密度、特異性等）均滿足臨床檢測試劑要求，臨床評測結果與進口產(chǎn)品性能相近，有望通過優(yōu)化后應用于生產(chǎn)，同時將進一步開發(fā)臨床疾病標志物的試劑。另一方面初步闡明了利用磁珠作為固相載體應用于時間分辨熒光免疫分析能夠提高檢測靈敏度，擴大線性范圍，縮短分析時間，提高檢測效率等優(yōu)點，有望進一步將其應用到多元分析中，在臨床分子診斷和食品檢測等生物化學分析中具有非常重要的