斑馬魚D3b基因結(jié)構(gòu)及其在胚胎發(fā)育中的作用研究.pdf

1、甲狀腺激素在調(diào)控細胞的生長代謝中發(fā)揮重要作用。在成年人中，甲狀腺激素調(diào)節(jié)一生的能量代謝水平。在胚胎、新生兒、兒童期，甲狀腺激素介導細胞增殖和分化。甲狀腺激素是通過T3與甲狀腺激素受體的結(jié)合起作用的，但正常情況下，甲狀腺分泌的主要是T4。T4在外環(huán)脫碘，而轉(zhuǎn)化為T3，這將使其生物活性明顯增強;而T4和T3若在內(nèi)環(huán)脫碘，將使它們分別生成為反T3(rT3)和T2，從而喪失其生物學活性。參與這一過程的主要是甲狀腺激素脫碘酶。在人和哺乳動物中主要

2、存在3種不同類型的甲狀腺激素脫碘酶，分別有3種不同的基因編碼(Deiodinase，簡稱dio)。其中有dio1和dio2編碼的甲狀腺激素脫碘酶1和2（簡稱D1，D2）是主要催化甲狀腺激素的外環(huán)脫碘，可使T4轉(zhuǎn)變?yōu)門3，從而增加甲狀腺激素的生物學活性。但有dio3編碼的甲狀腺激素脫碘酶3(簡稱D3)，主要發(fā)揮甲狀腺激素的內(nèi)環(huán)脫碘酶的功能，可以將T4和T3分別轉(zhuǎn)化為rT3和T2，從而是甲狀腺激素的活性喪失，它也是體內(nèi)唯一的催化甲狀腺激素失

3、活的酶。
　　斑馬魚中由于基因復制存在兩個dio3基因，一個是dio3a，一個是dio3b。我們研究的主要目的是鑒定是否兩個dio3基因都有功能以及它們在胚胎發(fā)育中的作用是否相同。研究發(fā)現(xiàn)這兩個基因與人dio3都是同源基因。體外研究證實同源基因dio3a，dio3b都可以編碼有活性的蛋白，都可以使T4和T3失活。雖然斑馬魚D3a和D3b酶的動力學性質(zhì)非常相似，但它們的基因結(jié)構(gòu)與表達模式非常不同。我們第一次鑒定了dio3b的基因結(jié)構(gòu)

4、不同于以往發(fā)現(xiàn)的任何dio3基因，含有一個巨大的內(nèi)含子將其開放閱讀框和硒氨酸插入序列(SECIS)分開。SECIS通常位于3'UTR上，是酶的催化活性和硒蛋白的合成所必須的，介導硒氨酸識別UGA密碼子。最大敏感性檢測發(fā)現(xiàn)斑馬魚D3a可以外環(huán)脫碘rT3，這與其他D3蛋白都不同。這些數(shù)據(jù)提示D3a和D3b在發(fā)育中的作用可能不同。
　　進一步研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的D1不能催化T4到T3的轉(zhuǎn)變，也不具有T3的內(nèi)環(huán)脫碘作用.這說明在斑馬魚體內(nèi)D

5、2是主要的催化甲狀腺激素激活的酶，D3是T4和T3主要的失活酶。
　　D3在人的胎盤和胎兒期表達最高，我們猜測其在胚胎發(fā)育中具有重要作用。利用morpholino介導的基因敲除我們發(fā)現(xiàn)dio3b敲除后斑馬魚胚胎發(fā)育明顯遲緩，72小時身體明顯變短。dio3a敲除后胚胎沒有明顯異常。dio3b敲除導致的身體變短的表型可以被甲狀腺激素拮抗劑部分逆轉(zhuǎn)，說明dio3b敲除身體變短的這一表型是通過甲狀腺激素的信號途徑介導的特異表型，并且是由局

6、部組織的甲狀腺激素信號通路的升高引起的。給予外源性T3刺激時斑馬魚胚胎長度沒有明顯異常，但其體內(nèi)dio3b和dio3a的表達量和酶活都顯著升高。
　　甲狀腺激素誘導的凋亡在兩棲動物變態(tài)發(fā)育過程中非常重要。我們發(fā)現(xiàn)dio3b敲除后甲狀腺激素誘導凋亡的關(guān)鍵基因Bax和Bcl-XL有明顯上調(diào)，同時還發(fā)現(xiàn)tp53基因表達顯著升高。我們推測dio3b敲除身體變短這一表型與P53凋亡通路有關(guān)。P53 morpholino與dio3b morp

7、holino聯(lián)合注射可以逆轉(zhuǎn)dio3b敲除引起的凋亡和身體變短的表型。這說明局部組織甲狀腺激素信號通路的升高引起的身體變短是通過上調(diào)凋亡途徑引起的。
　　哺乳動物的胚胎發(fā)育無法避免母體甲狀腺激素水平的影響。因此在哺乳動物模型中研究脫碘酶D3在胚胎發(fā)育過程中的作用變得非常復雜。斑馬魚體外受精，我們dio3b敲除的斑馬魚模型為D3b可以獨立于母體甲狀腺激素水平調(diào)控胚胎大小提供了直接證據(jù)，單一基因dio3b的缺乏就可以導致斑馬魚胚胎身體