斑馬魚miR-125c在細(xì)胞低氧應(yīng)答和胚胎發(fā)育中的功能.pdf

1、低氧可以導(dǎo)致魚類攝食量減少，生長(zhǎng)減慢，胚胎發(fā)育受阻，甚至死亡，因此水中溶氧是影響魚類生存和進(jìn)化的重要環(huán)境因子。在機(jī)體應(yīng)對(duì)低氧應(yīng)激的過程中低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α(Hypoxia-inducible factor1α)是一個(gè)非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可通過與下游一系列靶基因的結(jié)合控制細(xì)胞低氧應(yīng)答。另外近年來也發(fā)現(xiàn)MicroRNA（miRNA）作為一類非編碼微小RNA，在低氧條件下對(duì)于調(diào)控細(xì)胞生存具有重要作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)低氧可引起miR-12

2、5c的上調(diào)表達(dá)，但其在低氧調(diào)控中的作用機(jī)制和生物學(xué)功能仍不明確。因此本研究構(gòu)建了包含miR-125c HRE(Hypoxiaresponse element)位點(diǎn)的啟動(dòng)子重組質(zhì)粒，分析了低氧條件下Hif-1α與miR-125c的調(diào)控關(guān)系;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-125c的靶標(biāo);并證明了miR-125c在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的作用以及在斑馬魚胚胎發(fā)育中的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1)MiR-125家族序列分析
　　

3、對(duì)多種硬骨魚類、人和小鼠miR-125進(jìn)化樹分析表明，miR-125c與miR-125b的同源性較高，推測(cè)miR-125c與miR-125b在功能上存在相似性。多序列比對(duì)研究斑馬魚、青鳉、人和小鼠的miR-125家族成熟序列的保守性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125a/b/c種子序列完全保守。
　　2)斑馬魚miR-125c受到Hif-1α的轉(zhuǎn)錄激活
　　CoCl2處理斑馬魚ZF4細(xì)胞后熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著低氧處理時(shí)間的增加

4、，miR-125c的表達(dá)逐漸上升。啟動(dòng)子分析顯示miR-125c啟動(dòng)子中包含4個(gè)HRE的結(jié)合位點(diǎn)，將含有4個(gè)HRE序列分別與pGL3-Basic連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅僅含有HRE1和HRE3的重組質(zhì)?？娠@著提高熒光素酶活性，說明HRE1和HRE3可能是miR-125c參與低氧應(yīng)答的重要元件。低氧條件下（CoCl2處理細(xì)胞12h），ZF4細(xì)胞轉(zhuǎn)染Hif-1α siRNA，結(jié)果顯示，Hif-1α敲降后內(nèi)源性Hif-

5、1α的表達(dá)量下降，相應(yīng)的miR-125c的表達(dá)水平也下降，這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-125c與Hif-1α的表達(dá)趨勢(shì)一致，因此推測(cè)miR-125c受到Hif-1α的轉(zhuǎn)錄激活。
　　3) Cdc25a是miR-125c的靶基因
　　生物信息學(xué)分析顯示斑馬魚cdc25a-3'UTR中存在miR-125c的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明psiCHECKM-2-cdc25a-3'UTR(wt)和miR-125c mimics共

6、轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶活性，而將突變質(zhì)粒psiCHECKTM-2-cdc25a-3'UTR和miR-125c mimics共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性沒有改變，說明miR-125c可通過“種子序列”UCCCUGAG與cdc25a基因3'UTR序列特異性結(jié)合，即cdc25a是miR-125c直接的靶基因。
　　4) miR-125c負(fù)調(diào)控cdc25a的表達(dá)
　　體外實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-125c導(dǎo)致cdc25a mRNA和蛋白水平明顯

7、降低;而抑制miR-125c的表達(dá)則造成cdc25a mRNA和蛋白水平顯著增加。將miR-125c mimics顯微注射到斑馬魚胚胎后，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-125c過表達(dá)可導(dǎo)致cdc25a的mRNA和蛋白表達(dá)量下降。此外，CoCl2處理ZF4細(xì)胞后，cdc25a的mRNA和蛋白表達(dá)量都隨著處理時(shí)間的增加而下降。因此體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都顯示miR-125c負(fù)調(diào)控cdc25a的表達(dá)。
　　5)miR-125c通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程抑

8、制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
　　利用CCK8試劑盒檢測(cè)miR-125c對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125c mimics后的36 h到60 h，細(xì)胞增殖受到抑制。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-125c阻滯細(xì)胞G1期進(jìn)程，引起控制G1/S轉(zhuǎn)換的Cdk2表達(dá)量的積累，G1期調(diào)節(jié)基因cdk2，cdk6和ccnd1的表達(dá)水平顯著增加，而S期調(diào)節(jié)基因cdk7和ccnh的表達(dá)水平顯著降低，轉(zhuǎn)染inhibitor后的表達(dá)趨勢(shì)相反

9、。
　　同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miR-125c過表達(dá)后細(xì)胞發(fā)生凋亡。基于AO染色顯示，miR-125c的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎頭部、眼部、尾部出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞。TUNEL的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)過表達(dá)miR-125c引起斑馬魚尾部凋亡信號(hào)增加，而且細(xì)胞凋亡現(xiàn)象也能被miR-125c inhibitor顯著性挽救。
　　6)miR-125c在斑馬魚胚胎發(fā)育中具有重要作用
　　研究發(fā)現(xiàn)miR-125c過表達(dá)后斑馬魚仔魚的圍心腔水腫，頭