HIV感染者不同感染階段自然殺傷細(xì)胞功能的變化.pdf

1、目的：
　　 獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的一種嚴(yán)重傳染病。目前由于沒(méi)有有效預(yù)防HIV感染的疫苗和根治的藥物,艾滋病仍然是無(wú)法攻克的難題。研究表明,在HIV感染過(guò)程中,免疫系統(tǒng)一方面受到病毒感染的損害,另一方面發(fā)揮抗病毒的功能,抑制病毒復(fù)制。自然殺傷細(xì)胞(na

2、tural killercell,NK)是天然免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)細(xì)胞,在控制腫瘤和微生物感染中發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于HIV慢性感染者NK細(xì)胞功能變化的研究結(jié)果不盡相同。另外,關(guān)于HIV原發(fā)感染者(primary HIV infection,PHI)和長(zhǎng)期不進(jìn)展者(Longterm non-progressor,LTNP)NK細(xì)胞功能的變化還鮮有報(bào)道。我國(guó)人群的NK細(xì)胞數(shù)量和亞群分布與歐美國(guó)家人群不同,因此對(duì)我國(guó)HIV感染者NK細(xì)胞功

3、能的研究非常重要。NK細(xì)胞作為機(jī)體抗腫瘤和感染的第一道防線,在獲得性免疫應(yīng)答之前就發(fā)揮免疫作用來(lái)保護(hù)機(jī)體,同時(shí)也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁,因此研究NK細(xì)胞功能在HIV疾病進(jìn)展中的變化具有重要的科學(xué)意義。本研究應(yīng)用多色流式細(xì)胞分析技術(shù),選擇interferon-γ(IFN-γ)、CD107a,和顆粒酶B對(duì)HIV感染者NK細(xì)胞分泌抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ功能以及細(xì)胞毒性功能進(jìn)行研究。
　　 方法：
　　 1、研究對(duì)象

4、
　　 選取未接受過(guò)抗病毒治療的HIV感染者,按感染時(shí)間不同選取HIV原發(fā)感染組(PHI組)10例、HIV慢性感染組(CHI組)18例。按疾病進(jìn)展不同選取分為長(zhǎng)期不進(jìn)展組(LTNP組)13例及典型進(jìn)展組(TP組)18例。健康對(duì)照組(NC組)為13例隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人,性別、年齡均與HIV感染者匹配。
　　 2、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值的檢測(cè)
　　 將20μl BD公司CD4 FITC/C

5、D8 PE/CD3 PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,逆向加樣法加入50μl混勻的抗凝全血,室溫避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室溫避光15min,應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),MultiSET軟件分析結(jié)果,得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)值。
　　 3、NK細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)
　　 復(fù)蘇凍存的人外周血單個(gè)核細(xì)胞,孵育過(guò)夜。與缺乏MHC-Ⅰ類(lèi)分子的K562細(xì)胞系(E:T為5:1)共孵育,同時(shí)加入抗CD

6、107a抗體和GolgiStop,共同孵育6小時(shí)。用抗體組合CD3-Percp/CD56-Pe-cy7(美國(guó)BD公司)進(jìn)行表面染色。使用BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Kit(美國(guó)BD公司)進(jìn)行破膜10分鐘,胞內(nèi)染色I(xiàn)FN-γ-FITC,granzymeB-FITC(美國(guó)BD公司),4℃,30分鐘。用1％多聚甲醛固定。
　　 4、HIV病毒載量測(cè)定
　　 采

7、用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)HIV-1 Test試劑盒在Roche COBAS(R)AmpliPrp(R)上提取核酸后轉(zhuǎn)移到COBAS(R)TaqMan(R)系統(tǒng)進(jìn)行全自動(dòng)PCR反應(yīng)體系制備及病毒載量檢測(cè)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示,兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),相關(guān)

8、性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、HIV原發(fā)感染者和慢性感染者NK細(xì)胞功能的變化
　　 1、HIV原發(fā)感染者和慢性感染者NK細(xì)胞及亞群構(gòu)成情況
　　 HIV慢性感染者NK細(xì)胞百分比顯著低于健康對(duì)照組(P=0.034),而HIV原發(fā)感染者CD3-CD56dimNK細(xì)胞的百分比高于健康對(duì)照組和慢性感染者(P=0.014,P=0.015),CD3-CD5

9、6brightNK細(xì)胞百分比各組間無(wú)顯著差異。
　　 2、NK細(xì)胞分泌IFN-γ功能的變化
　　 各組產(chǎn)生IFN-γ的CD3-CD56+NK細(xì)胞百分比沒(méi)有顯著差異。原發(fā)感染者CD3-CD56dimNK細(xì)胞亞群分泌IFN-γ的百分比顯著低于HIV慢性感染者(P=0.017)。HIV慢性感染者CD3-CD56brightNK細(xì)胞亞群分泌IFN-γ的百分比高于健康對(duì)照者(P=0.027)。
　　 3、CD107a在NK

10、細(xì)胞表面表達(dá)的變化
　　 HIV慢性感染者CD3-CD56+NK細(xì)胞及CD3-CD56dim亞群CD107a表達(dá)水平高于健康對(duì)照組(P=0.033,P=0.034)。HIV原發(fā)感染者CD3-CD56brightNK細(xì)胞亞群表達(dá)CD107a水平高于慢性感染者和健康對(duì)照組(P=0.003,P＜0.001)。
　　 4、NK細(xì)胞顆粒酶B釋放情況比較
　　 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIV慢性感染者NK細(xì)胞顆粒酶B釋放的百分比顯

11、著高于健康對(duì)照組(P=0.026)。CD56dimNK亞群和CD56bright亞群顆粒酶B各組間無(wú)明顯差異。
　　 二、HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者NK細(xì)胞及各亞群功能特點(diǎn)
　　 1、HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者NK細(xì)胞及各亞群構(gòu)成情況
　　 結(jié)果顯示:HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者和典型進(jìn)展者CD3-CD56+NK細(xì)胞百分比顯著低于健康對(duì)照組(P=0.001,P+0.034)。在CD3-CD56dim亞群和CD3-CD56bri

12、ght亞群,各組間無(wú)明顯差異。
　　 2、HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者NK細(xì)胞及各亞群分泌IFN-γ功能特點(diǎn)
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD3-CD56+NK細(xì)胞分泌IFN-γ的水平較健康對(duì)照組高(P=0.034)’,在CD3-CD56dim亞群也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果(P=0.028)。典型進(jìn)展者和長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD56bright亞群的IFN-γ產(chǎn)生水平較健康對(duì)照組高(P=0.026,P=0.032),
　　 3、HIV

13、感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者NK細(xì)胞及各亞群表達(dá)CD107a功能特點(diǎn)
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD3-CDS6+NK細(xì)胞表達(dá)CD107a水平較健康對(duì)照組高(P=0.045),在CD3-CD56dimNK細(xì)胞亞群也有相同的結(jié)果(P=0.037)。而CD3-CD56bright亞群典型進(jìn)展者高于健康對(duì)照組和長(zhǎng)期不進(jìn)展者(P=0.012,P=0.024)。
　　 4、HIV感染長(zhǎng)期不進(jìn)展者NK細(xì)胞及各亞群顆粒酶B釋放功能特點(diǎn)
　　

14、 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期不進(jìn)展者CD3-CD56+NK細(xì)胞顆粒酶B釋放百分比高于典型進(jìn)展者和健康對(duì)照組(P=0.028,P=0.004),在CD3-CD56dim亞群也看到相同的結(jié)果(P=0.028,P=0.003),而CD3-CD56brightNK細(xì)胞亞群各組間無(wú)明顯差異。
　　 三、HIV感染者NK細(xì)胞功能與病毒載量、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性
　　 1、HIV感染者NK細(xì)胞功能與病毒載量的相關(guān)性
　　

15、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HIV感染者IFN-γ+NK細(xì)胞百分比與病毒載量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.382,P=0.015)。在CD3-CD56dimNK細(xì)胞亞群,IFN-γ分泌量與病毒載量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.320,P=0,044)。HIV感染者CD107a+NK細(xì)胞百分比與病毒載量無(wú)顯著相關(guān)性。
　　 2、HIV感染者NK細(xì)咆功能與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞及各亞群分泌IFN-γ的功能和CD107a的表

16、達(dá)與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、HIV慢性感染者NK細(xì)胞分泌抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ的功能和細(xì)胞毒性功能活躍,提示NK細(xì)胞在HIV感染進(jìn)入慢性感染階段后仍然發(fā)揮抗病毒功能。
　　 2、長(zhǎng)期不進(jìn)展者NK細(xì)胞分泌抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ的功能和細(xì)胞毒性功能增強(qiáng),其殺傷功能高于典型進(jìn)展者提示NK細(xì)胞功能增強(qiáng)是控制HIV感染疾病進(jìn)展的保護(hù)性因素。
　　 3、HIV感染者NK細(xì)胞產(chǎn)生I