感染早期HIV毒力對(duì)MSM人群HIV感染者疾病進(jìn)展影響的研究.pdf

1、目的：
　　由人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）感染引起的疾病稱為獲得性免疫缺陷綜合癥，又稱艾滋病。該病自1981年在美國首次發(fā)現(xiàn)以來，全球感染人數(shù)不斷上升，蔓延范圍越來越廣，至今尚無有效的治療方法，已成為全球人類最棘手的疾病之一。感染HIV后若不加以治療，結(jié)局通常都是死亡;然而，不同感染者從感染到死亡的時(shí)間差異很大:有的不到一年，有的卻超過二十年。導(dǎo)致HIV感染疾病進(jìn)展差異的原

2、因，目前仍然沒有一個(gè)明確的結(jié)論。揭示該原因可能會(huì)對(duì)了解和控制艾滋病提供線索。
　　研究顯示HIV感染者不同疾病進(jìn)展速率受多種因素的影響，主要包括病毒因素和宿主因素兩個(gè)方面。Herbeck等通過Meta分析發(fā)現(xiàn)HIV流行30年內(nèi)，感染者疾病進(jìn)展加快，指出感染者疾病進(jìn)展加快與HIV進(jìn)化導(dǎo)致毒力增強(qiáng)相關(guān)。該推論尚有待實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。
　　病原微生物致病力的強(qiáng)弱程度稱為毒力。HIV毒力是指病毒對(duì)宿主細(xì)胞吸附、侵入、在細(xì)胞內(nèi)生長和增殖以

3、及造成宿主免疫損傷等一系列能力的總和。病毒感染能力和復(fù)制能力都是反映HIV毒力的指標(biāo)。大量研究表明，基線CD4+T細(xì)胞數(shù)與感染者疾病進(jìn)展密切相關(guān)，目前關(guān)于感染早期HIV毒力與疾病進(jìn)展相關(guān)性研究較少。Hiroshi等對(duì)從疾病進(jìn)展快的HIV B亞型感染者體內(nèi)分離到的多重耐藥毒株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其HIV感染能力、復(fù)制能力均高于其他多重耐藥毒株和野生對(duì)照毒株。Julia G等對(duì)兒童HIVC亞型感染者血漿原代分離株進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)緩慢進(jìn)展者感染早期

4、/停藥一年后HIV分離株的復(fù)制能力明顯低于典型進(jìn)展者。目前CRF01-AE亞型HIV毒力與感染者疾病進(jìn)展相關(guān)性研究未見報(bào)道。
　　男男性接觸人群已經(jīng)成為我國艾滋病流行中一個(gè)新的快速增長人群，以CRF01-AE亞型感染為主。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)MSM人群HIV感染者進(jìn)展至AIDS期的時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于國外與國內(nèi)獻(xiàn)血、吸毒人群，快速進(jìn)展者比例高。但是，MSM人群中有一小部分感染者疾病進(jìn)展緩慢。導(dǎo)致MSM人群CRF01-AE亞型HIV感染者

5、疾病進(jìn)展不同的病毒學(xué)因素尚未明確。
　　從感染者體內(nèi)獲得的HIV原代分離株是具有感染性的HIV病毒顆粒，文獻(xiàn)報(bào)道單個(gè)核細(xì)胞來源HIV分離株與血漿病毒克隆序列具有很高的遺傳同源性。本研究以我國MSM人群CRF01-AE亞型HIV感染者單個(gè)核細(xì)胞來源原代分離株為研究對(duì)象，比較HIV分離株與血漿病毒env、gag區(qū)克隆序列基因多樣性，檢測(cè)感染早期HIV感染者體外病毒毒力，對(duì)毒力高低組感染者進(jìn)行生存分析，研究感染早期毒力對(duì)MSM人群HIV

6、感染疾病進(jìn)展的影響，探討MSM人群HIV感染者疾病進(jìn)展不同的病毒學(xué)因素。
　　方法：
　　一、研究對(duì)象
　　研究對(duì)象來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院MSM高危人群隨訪隊(duì)列，從2008年開始至今，每月或每3個(gè)月對(duì)隊(duì)列人群定期隨訪。選取感染早期HIV新發(fā)感染者標(biāo)本。根據(jù)疾病進(jìn)程分為疾病快速進(jìn)展者（Rapid progressors，RP）組和疾病典型進(jìn)展者(Typical progressors，TP)組。分組標(biāo)準(zhǔn)為:RP，感

7、染1年內(nèi)CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)低于350 cells/μl。TP，感染1年內(nèi)CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)始終高于500 cells/μl或感染3年內(nèi)CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)始終高于350 cells/μl。通過PBMC共培養(yǎng)方法分離HIV，p24復(fù)制峰值＞10ng/ml。按上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，共選取22例HIV新發(fā)感染者基線點(diǎn)病毒分離株，其中RP組11例，TP組11例。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬〤D4+T淋巴細(xì)胞測(cè)定
　　20μ

8、l CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min，用FACS MMLTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析、計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。
　?。ǘ┎《据d量測(cè)定
　　以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV Monitor1.5 commercial kit在C

9、OBASAMPLICOR自動(dòng)載量儀上以RT-PCR方法測(cè)定病毒載量。檢測(cè)范圍為50-1×107copies/ml。
　?。ㄈ┱Ｈ薖BMC提取及CD8+T細(xì)胞分選
　　采集正常人EDTA抗凝靜脈血，應(yīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，提取PBMC。取正常人PBMC，采用STEMCELL公司EasySepTM Human CD8Positive Selection Kit試劑盒分選CD8+T細(xì)胞，去CD8 PBMC

10、用于病毒擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
　?。ㄋ模〩IV分離株擴(kuò)增
　　本擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)使用同一批去CD8正常人PBMC，以保證體外實(shí)驗(yàn)均一性。取10ng病毒株感染5×106植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA）刺激后去CD8正常人PBMC2.5h，加5ml培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×106/ml，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱。每周補(bǔ)充PHA刺激后正常人PBMC;每3～4天收集培養(yǎng)上清并補(bǔ)充培養(yǎng)基。ELISA法定量測(cè)定p24抗原含量，繪制

11、病毒生長曲線。p24抗原大于10ng即擴(kuò)增陽性，收集病毒液培養(yǎng)陽性上清，-156℃深低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　?。ㄎ澹﹑24抗原檢測(cè)
　　使用曠博公司HIV p24抗原定量檢測(cè)試劑盒(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。
　　（六）血漿病毒與分離株序列分析
　　1、病毒RNA提取
　　2、逆轉(zhuǎn)錄cDNA
　　3、PCR擴(kuò)增
　　4、PCR產(chǎn)物純化
　　5、目的DNA與pMDTM

12、18-T載體連接
　　6、感受態(tài)大腸桿菌的制備
　　7、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
　　8、陽性克隆的篩選
　　9、質(zhì)粒小提
　　10、核酸序列測(cè)定和序列結(jié)果分析
　　11、基因距離計(jì)算
　?。ㄆ撸〩IV分離株感染能力檢測(cè)（TZM-bl細(xì)胞系）
　　使用TZM-bl細(xì)胞系檢測(cè)HIV分離株半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50％ tissueculture infectious dose，TCID50)。具體操作如

13、下:取病毒液在96孔培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋，共設(shè)7個(gè)倍比稀釋度(4-3～4-9)，重復(fù)四次。調(diào)整TZM-bl細(xì)胞系細(xì)胞濃度至0.1×106/ml，取50μl至上述各孔中。48h后，吸出150μl上清液，加入100μl熒光素酶染料，取150μl至96孔黑板，于96微孔板型多功能檢測(cè)儀檢測(cè)讀數(shù)，Speaman-Karber公式計(jì)算TCID50。
　?。ò耍〩IV分離株感染能力檢測(cè)（Ghost CCR5細(xì)胞系）
　　使用Ghost

14、 CCR5細(xì)胞系檢測(cè)HIV分離株單輪感染力。取2500pg毒株感染4×104 Ghost CCR5細(xì)胞（感染復(fù)數(shù)＞0.02），重復(fù)2次。調(diào)整體系總體積為300μl/孔。22℃，15009離心3h，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱。24h后收獲細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)百分率。
　?。ň牛〩IV分離株復(fù)制能力檢測(cè)
　　本復(fù)制能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使用同一批去CD8正常人PBMC，以保證體外實(shí)驗(yàn)均一性。PHA（終濃度5μg/ml）預(yù)刺激

15、PBMC3天。取2000 TCID50毒株感染2×106去CD8正常人PBMC4h（感染復(fù)數(shù)為0.001），重復(fù)2次。PBS300g離心10min洗兩次，移入24孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每周補(bǔ)充PHA刺激后正常人PBMC;每周一、三、五收集培養(yǎng)上清并補(bǔ)充培養(yǎng)基。ELISA法定量測(cè)定p24抗原含量，繪制病毒生長曲線。
　?。ㄊ┙y(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS18.0軟件分析，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)P＞0.05

16、總體分布符合正態(tài)分布的資料兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);對(duì)P＜0.05不符合正態(tài)分布的資料采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn);樣本構(gòu)成比分析采用卡方檢驗(yàn);生存分析采用Kaplan-Meier曲線（K-M曲線）計(jì)算生存率， Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行生存率的比較。統(tǒng)計(jì)概率采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、HIV原代分離株擴(kuò)增陽性病例基本信息
　　擴(kuò)增結(jié)果陽性標(biāo)準(zhǔn)為p24抗原＞10ng/ml。標(biāo)

17、本陽性共22例，其中RP組11例，TP組11例。
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象均為CRF01-AE亞型。RP組感染時(shí)間與TP組無顯著性差別(P＞0.05)。RP組基線CD4+T細(xì)胞顯著低于TP組(P＜0.0001);RP組基線病毒載量與TP組無顯著性差別。RP組調(diào)定點(diǎn)CD4+T細(xì)胞顯著低于TP組; RP組調(diào)定點(diǎn)病毒載量顯著高于TP組(P=0.009);RP組1年點(diǎn)CD4+T細(xì)胞顯著低于TP組(P＜0.0001);RP組1年點(diǎn)病毒載量顯著高于TP組

18、(P=0.005)。
　　二、HIV分離株與血漿病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹基因多樣性分析
　　對(duì)同時(shí)具有HIV分離株和血漿病毒標(biāo)本的gag區(qū)（8例）和env區(qū)（4例）分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹基因多樣性分析。結(jié)果顯示HIV分離株與血漿病毒序列一致或者非常接近（Bootstrap≥85％），具有遺傳同源性。
　　三、感染早期TP組與RP組感染能力比較
　　RP組與TP組感染滴度無顯著性差異(P＞0.05)。本研究中22例毒株均為CCR

19、5嗜性，可采用CCR5細(xì)胞系檢測(cè)毒株單輪感染力，RP組平均GFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于TP組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　四、感染早期TP組與RP組復(fù)制能力比較
　　RP組分離株復(fù)制曲線p24峰值中位數(shù)對(duì)數(shù)為3.94pg/ml; TP組分離株復(fù)制曲線p24峰值中位數(shù)對(duì)數(shù)為3.49pg/ml。RP組分離株復(fù)制能力顯著高于TP組(P=0.041)。
　　五、感染早期HIV復(fù)制能力與感染者基線、調(diào)定點(diǎn)、1年點(diǎn)CD4+T

20、細(xì)胞數(shù)和病毒載量相關(guān)性分析
　　感染早期病毒復(fù)制能力與基線CD4+T細(xì)胞數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.006)，與基線病毒載量不相關(guān)(P＞0.05);感染早期病毒復(fù)制能力與調(diào)定點(diǎn)CD4+T細(xì)胞數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.049)，與調(diào)定點(diǎn)病毒載量呈正相關(guān)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);感染早期病毒復(fù)制能力與感染者1年點(diǎn)CD4+T細(xì)胞數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.036)，與1年點(diǎn)病毒載量呈正相關(guān)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

21、　　六、復(fù)制能力高組和低組疾病進(jìn)展快慢人數(shù)構(gòu)成比比較
　　22例標(biāo)本根據(jù)病毒復(fù)制曲線p24峰值中位數(shù)分為兩組，即復(fù)制高組(＞Medianpeak p24)和復(fù)制低組(＜Median peak p24)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示RP組標(biāo)本在復(fù)制高組分布顯著高于復(fù)制低組(P＜0.05);而TP組標(biāo)本在復(fù)制低組分布顯著高于復(fù)制高組(P＜0.05)。
　　七、復(fù)制能力高組和低組感染者生存分析
　　以CD4+T細(xì)胞數(shù)＜350cells/

22、μl作為隨訪終點(diǎn)，對(duì)復(fù)制能力高組和低組進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，采用Wilcoxon進(jìn)行兩組生存率的比較。結(jié)果顯示復(fù)制能力高組HIV感染者中位生存時(shí)間為93天，平均生存時(shí)間為147.18天;復(fù)制能力低組HIV感染者中位生存時(shí)間為1356天，平均生存時(shí)間為1388.27天。復(fù)制能力高組HIV感染者生存時(shí)間顯著短于復(fù)制能力低組(P＜0.0001)。
　　結(jié)論：
　　1、MSM人群CRF-01AE亞型HIV原發(fā)感染者感