可溶性PD-L1分子在結(jié)核性胸腔積液中的表達特性及生物學意義.pdf

1、肺結(jié)核是長期嚴重危害人類健康的慢性傳染病,也是單因素所致感染性疾病中病死率最高的疾病之一。結(jié)核性胸膜炎作為肺外結(jié)核的類型之一,約占肺結(jié)核患者的10％-20％,其中約10％-30％的結(jié)核性胸膜炎患者臨床有胸腔積液表現(xiàn)。結(jié)核性胸腔積液作為常見的滲出性胸腔積液之一,胸水Th1細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起主導(dǎo)作用,但近來研究結(jié)果表明,除了Th1型免疫反應(yīng),Th2、Th9、Th17、Th22等免疫細胞亞群及協(xié)同刺激分子在結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展中亦具有

2、重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),協(xié)同刺激分子PD-L1(programmed death-1 ligand1,程序性死亡配體1,又名B7-H1)在激活的T淋巴細胞、B淋巴細胞及單核-巨噬細胞等多種免疫細胞表面表達增高,并與機體的免疫抑制相關(guān)。業(yè)已證明,肺結(jié)核患者外周血中PD-1、PD-L1表達顯著增高,可能與結(jié)核病免疫耐受及慢性化炎癥相關(guān)。許多協(xié)同刺激分子如OX40、OX40L(OX40配體)、B7-H3和CTLA-4(細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原-

3、4)等除膜型外,還以可溶性的形式存在。既往對肺癌患者外周血可溶性PD-L1(sPD-L1)檢測發(fā)現(xiàn),肺癌患者血清sPD-L1表達異常增高,并與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和療效相關(guān)。而胸腔積液中是否存在sPD-L1及sPD-L1在結(jié)核性胸腔積液中的生物學意義的研究并不多見。
　　本研究中,我們采用蘇州大學生物技術(shù)研究所自主研發(fā)的特異性人sPD-L1的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測體系對結(jié)核性胸腔積液患者開展深入研究,檢測結(jié)核性胸腔積液中sPD

4、-L1的表達,分析其臨床指導(dǎo)意義,揭示sPD-L1和PD-1/PD-L1協(xié)同刺激信號與結(jié)核性胸腔積液疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,進一步探究sPD-L1在結(jié)核性胸腔積液中的生物學意義。為免疫學方法在結(jié)核性胸腔積液中的治療提供依據(jù)。
　　一、可溶性PD-L1在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血中的表達水平及臨床意義
　　【目的】檢測結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液和外周血中可溶性PD-L1的表達水平并探討其臨床意義。
　　【方法】篩選20

5、12年6月至2013年3月蘇州大學附屬第二醫(yī)院呼吸科收治的初診胸腔積液患者68例,其中結(jié)核性胸腔積液組共24例,惡性胸腔積液組共30例,非結(jié)核、非惡性胸腔積液組14例。收集上述人群胸腔積液和外周血清并記錄其臨床資料。采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測胸腔積液和外周血中sPD-L1的水平。流式細胞法(FCM)檢測胸腔積液和外周血中CD4+T細胞的表達、CD8+T細胞的表達、PD-1在CD4+T細胞上的表達(CD4+-PD-1)、PD-

6、1在CD8+T細胞上的表達(CD8+-PD-1)、CD14+單核細胞和PD-L1在CD14+單核細胞上的表達(CD14+-PD-L1)。反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測胸腔積液中PD-L1、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)基因表達。受試者工作特征(ROC)曲線分析sPD-L1對結(jié)核性胸腔積液的診斷價值。
　　【結(jié)果】結(jié)核性胸腔積液中sPD-L1含量顯著高于惡性組和非結(jié)核、非惡性組(P<0.0001);所有患者胸腔積液中的sPD-L1平均含量顯著高

7、于外周血中(P=0.0033)。結(jié)核組胸腔積液中CD8+細胞比例和PD-L1在CD14+單核細胞表達(CD14+-PD-L1)比例均高于惡性組及非結(jié)核、非惡性組(P=0.0001,P<0.0001)。反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示結(jié)核性胸腔積液中PD-L1 mRNA表達增高,且與MMP-3表達水平相關(guān)(r=0.887,P<0.0001)。ROC曲線分析顯示,單因素檢測胸腔積液sPD-L1診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感度為82.6％,特異度為82.9％,

8、曲線下面積為0.840。
　　【結(jié)論】 sPD-L1反映了不同病因胸腔積液微環(huán)境中不同的免疫功能狀態(tài),結(jié)核性胸腔積液中sPD-L1表達明顯增高,可能與結(jié)核性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),胸水中sPD-L1檢測有助于結(jié)核性胸腔積液的鑒別診斷。
　　二、結(jié)核性胸腔積液中IFN-γ和IFN-α的表達及PD-1/PD-L1協(xié)同刺激信號在結(jié)核性胸膜炎中的免疫學作用
　　【目的】檢測結(jié)核性胸腔積液中IFN-γ和IFN-α的表達水平并分

9、析其臨床意義;探討PD-1/PD-L1協(xié)同刺激信號在結(jié)核性胸膜炎中的免疫學作用。
　　【方法】收集上述68例胸腔積液患者胸腔積液標本,采用ELISA法檢測胸腔積液中IFN-γ和IFN-α的表達水平。分離健康成人外周血單個核細胞(PBMCs),以不同濃度結(jié)核性胸腔積液刺激培養(yǎng)后采用流式細胞術(shù)(FCM)檢測PBMCs細胞表面PD-L1的表達變化,CCK-8摻入法檢測PBMCs增殖的改變。免疫磁珠法分選結(jié)核性胸腔積液中T淋巴細胞和CD1

10、4+單核細胞,CCK-8摻入法檢測共培養(yǎng)體系中T細胞增殖的改變。
　　【結(jié)果】結(jié)核性胸腔積液組中IFN-γ含量顯著高于惡性組和非結(jié)核、非惡性組(P<0.0001);而三組患者胸腔積液中IFN-α含量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。胸腔積液中sPD-L1表達與Th1型主要細胞因子IFN-γ及胸腔積液腺苷脫氨酶(ADA)表達成正相關(guān)(P=0.0004,P<0.0001)。聯(lián)合胸腔積液sPD-L1、CD14+-PD-L1、IFN-γ及AD

11、A可使診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感度達87.0％,特異度達100％,曲線下面積達0.981。結(jié)核性胸腔積液可體外刺激CD14+單核細胞表面PD-L1的表達及PBMCs的增殖。高表達PD-L1的胸腔積液單核細胞能通過PD-1/PD-L1信號抑制T淋巴細胞的增殖和活化,采用抗PD-L1抗體特異性阻斷該抑制信號可部分恢復(fù)T淋巴細胞的增殖活性(P=0.005)。
　　【結(jié)論】結(jié)核性胸腔積液中IFN-γ表達增高,與胸腔積液中sPD-L1表達成正

12、相關(guān);聯(lián)合IFN-γ及各臨床指標檢測有助于結(jié)核性胸腔積液的鑒別診斷;高表達的Th1型細胞因子IFN-γ可能與PD-1/PD-L1協(xié)同刺激信號在結(jié)核性胸膜炎中的免疫作用相關(guān)。
　　綜上所述,本課題研究獲得了以下研究結(jié)果:(1)結(jié)核性胸腔積液中sPD-L1、Th1型細胞因子IFN-γ、CD8+細胞表達和PD-L1在CD14+單核細胞表達增高,sPD-L1單因素檢測或聯(lián)合各臨床指標有助于結(jié)核性胸腔積液的診斷。(2)結(jié)核性胸腔積液可體外促