外源性脂肪源干細胞移植改善D-半乳糖致衰老大鼠性能力的研究.pdf

1、背景：衰老(senescence)又稱老化，是整個機體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機能的全面衰退，是一個動態(tài)的、復(fù)雜的過程。當(dāng)前預(yù)防和延緩衰老已成為生命科學(xué)研究的熱點。有關(guān)衰老機制的研究一直是生物學(xué)、老年醫(yī)學(xué)研究的前沿課題。對其機制的研究中有自由基學(xué)說、代謝學(xué)說、免疫系統(tǒng)退化學(xué)說、端粒酶變化等多種學(xué)說，但沒有一種學(xué)說能完整解釋衰老的機制。原林教授提出的“筋膜學(xué)說”認為:人體由兩部分組成，一個是由尚未分化的非特異性結(jié)締組織（筋膜）支架所構(gòu)成的支持與儲備

2、系統(tǒng)，一個是以已分化的功能細胞為基礎(chǔ)的功能系統(tǒng)。功能系統(tǒng)在支持與儲備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，而支持與儲備系統(tǒng)源源不斷的為功能系統(tǒng)的細胞更新和功能活動提供細胞供應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)。功能系統(tǒng)是以功能細胞的專能特化為基礎(chǔ)的，而支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架以干細胞為核心，通過分化出各種定向干細胞，為功能系統(tǒng)的更新提供源源不斷的細胞補充，并為功能系統(tǒng)的各種細胞的更新、代謝提供一個穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。即衰老是筋膜中干細胞儲備逐漸耗竭的過程，而如何保持筋膜

3、的正常狀態(tài)，從而為功能系統(tǒng)提供穩(wěn)定的細胞來源并維持其向功能細胞的正常分化，是延長生命周期的關(guān)鍵。如果衰老時減少的干細胞能得到及時的補充，為機體提供新的細胞儲備，可修復(fù)機體損傷，延緩衰老、延長生命周期。不同于其他的衰老學(xué)說，筋膜學(xué)說從另一個不同的角度-發(fā)育生物學(xué)-對衰老提出了新的認識，同時與從微觀角度提出的各種衰老學(xué)說并無矛盾，認為各種微觀角度的改變最終導(dǎo)致的結(jié)果都是筋膜組織——支持與儲備系統(tǒng)功能的減退。間充質(zhì)干細胞(menchymal

4、stem cells)具有自我更新、多向分化的能力。最初是由Friendenstein等發(fā)現(xiàn)，而且證明其在體外可以分化成為成骨細胞及脂肪細胞，而后其它的研究小組發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs不僅可以分化為中胚層來源的組織，而且可以分化為內(nèi)胚層和外胚層來源的組織。而且間充質(zhì)干細胞的多組織來源與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布是一致的，其縱向、橫向分化的生物學(xué)特性與筋膜學(xué)提出的筋膜結(jié)締組織對機體的支持儲備作用也是一致的。脂肪源干細胞(ADSCs)是筋膜中

5、未分化干細胞的一種儲備形式。ADSCs具有多向分化潛能，能夠跨胚層分化。它可以分化成中胚層來源的脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞;外胚層來源的神經(jīng)細胞;也可以分化成內(nèi)胚層來源的內(nèi)皮細胞及肝細胞等。ADSCs具有低免疫原性，免疫調(diào)節(jié)功能和分泌細胞因子等能力，為異體移植提供了有利條件，使ADSCs成為生物治療的亮點之一;ADSCs分泌細胞因子抗老化的作用，已經(jīng)被臨床廣泛應(yīng)用。ADSCs不僅可以用來進行各種退行性和衰竭疑難病的替代治療，

6、而且可用來進行輔助的免疫治療。脂肪源干細胞可以調(diào)節(jié)受損組織局部微環(huán)境，可以分泌一系列細胞因子和生長因子到周圍組織液中，調(diào)節(jié)組織微環(huán)境，形成有利于干細胞生長的微環(huán)境——“干細胞巢”——招募來自于受體的內(nèi)源性干細胞到達靶點，并使其向所需要的特定組織細胞定向分化。脂肪干細胞本身能夠耐受缺氧，同時在缺氧的環(huán)境中還能釋放抗氧化物質(zhì)、自由基清除劑、分子伴侶、熱休克蛋白等，清除受損局部的細胞毒性物質(zhì)，促進尚存活的細胞復(fù)蘇，在脂肪移植后形成有利于組織細

7、胞存活和功能維持的微環(huán)境。ADSC還有可能通過旁分泌細胞因子促進組織修復(fù)。經(jīng)靜脈注射的ADSC可自主聚集于病灶部位參與修復(fù)損傷。ADSC的這種“歸巢”作用，其具體機制不明。有報道稱通過增加膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(membranetype1matrix metallop roteinase，MT1-MMP)表達和促進MMP-2酶原的激活可增強ADSCs的遷移。近期研究發(fā)現(xiàn)，ADSC能釋放新的線粒體至損害的細胞，從而挽救有氧代謝的過程。這說明

8、ADSC可通過多種機制參與組織的修復(fù)。簡言之，ADSCs可能通過以下機制修復(fù)或者重建組織:首先，ADSCs被植入一個受損的或是壞死的組織，它們能以副分泌的方式分泌出細胞活素和生長因子以刺激修復(fù)。ADSCs可以提供抗氧化劑、自由基清除劑、熱休克蛋白等給待修復(fù)組織，從而清除局部環(huán)境中所釋放的有毒物質(zhì)，促進仍存活的細胞的修復(fù)。另外，ADSCs可以通過刺激內(nèi)生性干細胞補充到待修復(fù)的臟器或自身直接遷移補充到待修復(fù)區(qū)域，以調(diào)節(jié)干細胞的微環(huán)境，并且促

9、進它們沿著需要的方式分化為功能細胞，從而更新機體衰老的功能細胞，維持機體平衡。D-gal所致亞急性衰老模型是國內(nèi)外比較公認的衰老模型。在一定時間內(nèi)連續(xù)給動物注射D-半乳糖使機體細胞糖代謝及脂代謝紊亂，體內(nèi)糖濃度增高后被醛糖還原酶催化還原成半乳糖醇，其不能被細胞進一步代謝而堆積體內(nèi)、影響正常滲透壓，導(dǎo)致細胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，不僅破壞并消耗機體抗氧化防御系統(tǒng)，使自由基積聚;同時在半乳糖還原成半乳糖醇的過程中又使細胞膜脂質(zhì)受損，過氧化

10、脂質(zhì)、脂褐素增高，出現(xiàn)衰老。糖代謝紊亂必然會引起心、肝、腎、腦等重要器官代謝異常，最后出現(xiàn)衰老。D-半乳糖模型因全面影響細胞的代謝功能和一些重要的酶的功能，所導(dǎo)致的老化較全面。其老化與機能減退的具體機制可能與代謝障礙、免疫損傷、自由基損傷及線粒體損傷等相關(guān)。目前，該模型已廣泛應(yīng)用于研究衰老機制以及延緩衰老藥物的篩選。D-gal致亞急性衰老模型可以模擬腦、肝臟、腎臟、皮膚、性腺軸、骨質(zhì)疏松、免疫系統(tǒng)等多臟器的損傷。文獻報道可應(yīng)用干細胞移植

11、治療，亦有文獻報道應(yīng)用中藥提取物、中藥湯方、激素及針灸等多種方法治療此模型造成的衰老。雄激素可提高性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，誘發(fā)性欲沖動，從而維持正常的性機能。睪丸間質(zhì)細胞(Leydig cells)是機體分泌睪酮的主要細胞，分泌量約占身體總睪酮的95％;國際上對男性生殖疾病治療的研究也多集中在Leydig細胞的培養(yǎng)和移植上。睪丸間質(zhì)細胞具有合成、分泌睪酮的特點。睪酮合成過程中，17β-HSD3、3β-HSD1催化脫氫異雄酮形成睪酮。而3

12、β-HSD是合成睪酮的關(guān)鍵酶，成年大鼠睪丸中只有間質(zhì)細胞表達3β-HSD，所以目前對間質(zhì)細胞的鑒定一般都采用3β-HSD特異性染色方法。Percoll梯度濃度分離的Leydig細胞量大、純度較高、細胞活力良好，初步解決了組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織的種子細胞來源的問題。用該方法獲得的Leydig細胞所構(gòu)建的組織工程化雄激素分泌組織能在較長時期維持睪酮分泌功能。為探討外源性脂肪源干細胞移植是否具有延緩衰老的作用及其作用機制，本實驗體內(nèi)觀

13、察移植外源性ADSCs對D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠自由基及免疫等衰老指標(biāo)，以及對衰老大鼠性能力的改善等方面的影響;體外觀察脂肪源干細胞基質(zhì)與D-gal處理的睪丸間質(zhì)細胞(LCs)共培養(yǎng)，探討ADSCs對Leydig cell的保護性作用，探索一種新的抗衰老機理，為臨床延緩衰老的治療提供新的思路和方法。
　　 目的：研究移植脂肪源干細胞對D-半乳糖致衰老大鼠相關(guān)衰老指標(biāo)以及交配能力的影響，探討臨床替代療法的治療機理，進一步為

14、筋膜結(jié)締組織是干細胞的儲備源泉提供證據(jù)支持，為筋膜學(xué)提供理論支撐。①檢驗非特異性筋膜結(jié)締組織中是否存在脂肪源干細胞。②觀察移植脂肪源干細胞能否對D-半乳糖衰老大鼠的血清、自由基及免疫功能產(chǎn)生影響，闡述移植脂肪源干細胞對抗D-半乳糖衰老的血清學(xué)意義。③通過觀察交配實驗，研究移植筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細胞能否提高D-半乳糖致衰老大鼠的性能力;通過免疫組織化學(xué)染色，觀察移植標(biāo)記的脂肪源干細胞在睪丸組織中的定位和移位情況，及睪丸間質(zhì)細胞分泌3

15、β-HSD、17β-HSD的情況;通過免疫組織化學(xué)染色，觀察睪丸間質(zhì)細胞細胞形態(tài)學(xué)變化及其凋亡狀況;通過血清學(xué)檢測，觀察睪酮分泌狀況。④體外分離培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細胞，觀察脂肪干細胞對D-gal處理的睪丸間質(zhì)細胞的保護性作用，為“筋膜學(xué)”抗衰老相關(guān)理論提供進一步佐證。
　　 方法：⑴取成年SD大鼠腹股溝脂肪墊，用酶消化法分離、培養(yǎng)筋膜結(jié)締組織的脂肪源干細胞。通過用形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織源細胞是否符合間充質(zhì)干

16、細胞的特性，進而判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否含有間充質(zhì)干細胞。⑵體外Percoll分離液梯度分離培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細胞，并通過形態(tài)學(xué)及3β-HSD特異性染色鑒定;以0、4、8、12、16g/L不同濃度的D-gal處理睪丸間質(zhì)細胞，每個濃度做三個復(fù)孔，每個孔重復(fù)三次。24h后，計算細胞存活率，篩選最適濃度模擬細胞衰老模型;另流式細胞儀檢測8g/L D-半乳糖處理Leydig cell在0、24、48、72h不同時間點的細胞周期變化。⑶體外分離

17、培養(yǎng)4代ADSCs，取上清制備脂肪干細胞基質(zhì)(ADSC-CM);8g/L D-半乳糖處理Leydig cell，同時與ADSC-CM共培養(yǎng)24h后，MTT檢測其細胞活性;流式細胞儀檢測各組細胞共培養(yǎng)24h的周期變化;共培養(yǎng)48h，SA-β-半乳糖酐酶染色，每組取4個視野，每個視野至少100個細胞。檢測細胞衰老情況;免疫組化觀察3β-HSD分泌情況。⑷30只SD大鼠隨機分成空白對照組（A組）、模型組（B組）和治療組（C組），每組10只。B

18、、C組頸背部皮下注射15％D-半乳糖1000mg/（kg·d），連續(xù)8周復(fù)制亞急性衰老模型，A組的大鼠每天給予生理鹽水1.6ml頸背部皮下注射。⑸模擬衰老模型成功后，治療組內(nèi)的大鼠進行脂肪源干細胞靜脈移植:移植的第3代ADSCs在進行傳代后，在培養(yǎng)基中摻入10μmol/L的Brdu，孵育3天后消化收集，無菌生理鹽水重懸，制成300萬/ml;同樣每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射ADSCs3×106個，模型組輸入生理鹽水1ml。⑹交配實驗的雌鼠分別在實

19、驗前48h和4h采用皮下注射苯甲酸雌二醇200μg/kg和黃體酮2mg/kg用來誘導(dǎo)雌鼠發(fā)情，用發(fā)情的雌鼠和雄鼠進行交配，從而對雄性進行相關(guān)性能力研究。HE染色顯示大鼠睪丸組織精曲小管結(jié)構(gòu)變化，采用免疫組化及免疫熒光追蹤移植細胞;免疫組化觀察3β-HSD1、17β-HSD3分泌情況，TUNEL免疫組化染色觀察大鼠間質(zhì)細胞凋亡指數(shù)。放射免疫法觀察大鼠血清睪酮含量。⑺采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，方差齊

20、時，多樣本均數(shù)比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法;方差不齊時，多樣本均數(shù)比較均采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3方法，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：①腹股溝皮下筋膜結(jié)締組織內(nèi)的脂肪源干細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征，可形成細胞集落，體外可以誘導(dǎo)分化為成骨細胞、脂肪細胞。②體外Percoll分離法可成功分離培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細胞。間質(zhì)細胞呈多邊形、三角形。單層貼壁生長，伸展后呈漩渦狀排列

21、，細胞以集落形式增殖;經(jīng)3β-HSD特異性染色鑒定，鏡下可見睪丸間質(zhì)細胞被染成藍黑色而其他睪丸細胞不著色，睪丸間質(zhì)細胞純度可達到95％以上;MTT法顯示8g/L的D-gal模擬衰老模型細胞存活率為(81.96±0.96)，為最適濃度，可成功誘導(dǎo)leydig cell老化(F=8960.772，P=0.000);且隨時間延長，8g/L的D-gal處理的LCs呈現(xiàn)G0/G1期細胞增多，S期細胞減少。③ADSCs上清中可以提取出ADSCs-C

22、M。空白對照組、8g/LD-gal處理的Leydig cells組、8g/LD-gal處理的Leydig cells與ADSCs-CM共培養(yǎng)組做比較，三組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1101.980，P＜0.001）。MTT檢測顯示其細胞活性有所提高(P＜0.001);流式細胞儀共培養(yǎng)24h后，細胞周期中G0/G1期細胞比例下降;空白對照組、8g/LD-gal處理的Leydig cells組、共培養(yǎng)組之間的SA-β-半乳糖酐酶陽性細胞數(shù)差

23、異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1105.307，P＜0.001);共培養(yǎng)48h，SA-β-半乳糖酐酶染色，共培養(yǎng)組SA-β-半乳糖酐酶陽性細胞減少(P＜0.001)，細胞衰老減輕;免疫組化觀察共培養(yǎng)后細胞分泌的3β-HSD分泌情況增加。④連續(xù)皮下注射D-gal可以模擬大鼠衰老。空白對照組、D-gal處理組、ADSCs-移植組之間的CuZn-SOD(F=28.587，P＜0.001)、NO水平(F=56.571，P＜0.001)、血清IL-2水平(

24、F=23.667，P＜0.001)、脾臟指數(shù)（F=33.830，P＜0.001）和胸腺指數(shù)(F=15.847，P＜0.001)、MDA水平(F=45.468，P＜0.001)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。衰老模型組與空白對照組比較，血清MDA水平有所升高(P＜0.001)，血清CuZn-SOD(P＜0.001)、血清NO(P＜0.001)、IL-2水平(P＜0.001)以及脾臟指數(shù)(P＜0.001)、胸腺指數(shù)(P＜0.001)均有所降低，提示D-半

25、乳糖模擬亞急性大鼠衰老模型復(fù)制成功。與模型組比較，細胞治療后衰老大鼠SOD活性(P=0.04)、血清IL-2水平(P=0.038)、血清NO水平(P＜0.001)和胸腺指數(shù)(P=0.002)、脾臟指數(shù)(P=0.001)均有所升高，MDA水平則降低(P＜0.001)。⑤空白對照組、D-gal模型處理組、ADSCs-移植組之間的血清睪酮含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.370,P＜0.001)，與空白對照組比較，模型組血清睪酮含量有所降低

26、(P＜0.001)，提示D-半乳糖亞急性大鼠衰老模型已復(fù)制成功。與模型組比較，細胞治療組血清睪酮含量有所升高(P=0.033)?？瞻讓φ战M、D-gal模型處理組、ADSCs-移植組之間的交配次數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.280，P＜0.001），與空白對照組比較，模型組大鼠交配次數(shù)有所減少(P＜0.001)，提示D-半乳糖亞急性大鼠衰老模型復(fù)制成功。經(jīng)過移植細胞治療后，與模型組比較，細胞治療組交配次數(shù)有提高(P=0.027)。睪丸

27、間質(zhì)細胞分泌3β-HSD、17β-HSD增多，而TUNEL染色顯示睪丸間質(zhì)細胞凋亡率降低(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：⑴筋膜結(jié)締組織脂肪源干細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征，可以形成細胞集落，與其它組織來源間充質(zhì)干細胞無顯著差別;細胞表面標(biāo)記物檢測中，4代貼壁ADSCs的特異性表面標(biāo)志物CD90、CD29表達率分別為90％以上，而CD49d、CD11b、CD45陰性表達，CD106弱表達;該細胞經(jīng)定向誘導(dǎo)后可以成骨、成脂肪

28、，與間充質(zhì)干細胞多向分化的功能一致。由此可以判斷在發(fā)育成熟大鼠的筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細胞。⑵通過Percoll梯度離心的方法，可以獲取穩(wěn)定的高純度的睪丸間質(zhì)細胞;3β-HSD特異性染色，可以對其鑒定。⑶中濃度的D-gal誘導(dǎo)細胞衰老，且可以保證細胞存活率。在高濃度環(huán)境下(16g/L)及中濃度(8g/L)的長時間作用下，可以誘使睪丸間質(zhì)細胞凋亡。⑷體外脂肪干細胞基質(zhì)與8g/L D-gal處理的睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)，可以明顯防護D

29、-半乳糖對睪丸間質(zhì)細胞的損害，提高細胞活性，減少衰老細胞數(shù)目。促進3β-HSD、17β-HSD的分泌，保護睪丸間質(zhì)細胞。⑸連續(xù)頸背部皮下注射D-gal可以有效模擬亞急性衰老模型。衰老大鼠在外觀上及自由基等方面，顯示顯著衰老征象。⑹尾靜脈移植脂肪源干細胞后，可顯著升高衰老大鼠體內(nèi)SOD含量、IL-2水平，而有效降低MDA含量，同時提高胸腺和脾臟指數(shù)。⑺移植脂肪源干細胞可以改善衰老老鼠的交配能力，促進睪酮釋放，同時保護睪丸間質(zhì)細胞。綜上所述

30、，本研究分別采用了細胞分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化、動物模型建立、HE染色和免疫組化、免疫熒光等技術(shù)手段，從血清學(xué)自由基及免疫功能方面，以及交配能力等多方面、多角度的探討了體內(nèi)移植外源性脂肪源干細胞對D-gal誘導(dǎo)的亞急性衰老大鼠的作用以及體外ADSCs-CM對D-gal處理的睪丸間質(zhì)細胞的保護作用。同時，體外ADSCs-CM可以降低D-gal對睪丸間質(zhì)細胞的毒性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，補充外源性的脂肪源干細胞可以延緩D-gal誘導(dǎo)的衰老，提高其生命質(zhì)