萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體微小顆粒骨治療感染性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　感染性骨缺損是創(chuàng)傷性慢性骨髓炎,是一種嚴(yán)重的骨組織感染性疾病,通?？蓪?dǎo)致骨的進(jìn)行性、炎性破壞,無(wú)法控制的炎癥破壞是其主要特點(diǎn),后期還存在對(duì)抗生素治療反應(yīng)不明感、反復(fù)復(fù)發(fā)等特征。革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致骨髓炎的最常見(jiàn)致病菌,占全部骨髓炎病例的80％左右,骨感染造成的死亡率達(dá)27-30%.萬(wàn)古霉素是目前臨床上用于治療由MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)引起的嚴(yán)重感染疾病的重要藥物,是目前國(guó)內(nèi)治療MRSA感

2、染的首選用藥。但是由于其全身用藥量較大,對(duì)耳腎均有毒性,局部用藥半衰期短,反復(fù)用藥又增加了感染率,無(wú)法達(dá)到有效的長(zhǎng)期控制感染的效果,給臨床治療帶來(lái)了困難。早在1906年,Ehrlich就提出了靶向給藥的設(shè)想,隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展,這一設(shè)想逐漸成為現(xiàn)實(shí)。1980年Klemm首次局部應(yīng)用慶大霉素/聚甲基丙烯酸酯防治骨及軟組織感染獲得成功引起了人們的重視。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)復(fù)乳-固化法制作萬(wàn)古霉素緩釋微球,復(fù)合微小顆粒骨一期植骨治療感染

3、性骨缺損的效果,探討新的治療感染性骨缺損的方法,為其應(yīng)用臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、載萬(wàn)古霉素PLGA微球的制備
　　取2mgPLGA溶解于20mL二氯甲烷中,攪拌制備成初乳相;取2mL吐溫-80,加入40mL蒸餾水中,以700r·m-1轉(zhuǎn)速攪拌制得第二初乳相;取1mL濃度為200mg·mL-1的萬(wàn)古霉素溶液,加入PLGA溶液中,4000r·m-1轉(zhuǎn)速下分散、攪拌,再將該混合液加入初乳相吐溫-80混合液

4、中,用高速分散器(XHF-D,寧波新芝生物科技股份有限公司)4000r·m-1轉(zhuǎn)速下分散,制成PLGA微球的初始液,室溫下持續(xù)攪拌4小時(shí)靜置待有白色沉淀附著燒杯底后,6000r·m-1(3-18K,SIGMA公司,德國(guó))速度離心清洗3遍后,-20℃冷凍干燥(Scient2-10N,寧波新芝生物科技股份有限公司),制得載萬(wàn)古霉素的PLGA微球。分別對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征及粒徑分布測(cè)定,微球中萬(wàn)古霉素的含量測(cè)定,含量測(cè)定中還包括:載藥率和包封率,

5、抗生素溶液穩(wěn)定性,體外釋放,微球中萬(wàn)古霉素活性和MIC測(cè)定。
　　2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　取48只家兔,按沈霖造模法造成雙側(cè)橈骨中上段慢性骨髓炎模型,將動(dòng)物隨機(jī)分為3組,每組16只。1個(gè)月后按常規(guī)方法將骨髓炎局部作徹底清創(chuàng),并造成橈骨中上段1cm節(jié)段性骨缺損的條件下,A組一期行自體小顆粒骨植入;B組一期行自體微小顆粒骨和萬(wàn)古霉素植入;C組一期行自體微小顆粒骨和萬(wàn)古霉素緩釋微球混合植入。分別于術(shù)前、術(shù)后1天、3天、1周、2周、4周測(cè)

6、定各組動(dòng)物血清C反應(yīng)蛋白及血沉,并于術(shù)后2周、4周、8周、12周每組處死4只兔子行植骨區(qū)大體形態(tài),X線及組織學(xué)觀察并進(jìn)行評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　1、微球測(cè)定結(jié)果
　　微球表面光滑、無(wú)孔隙,載藥率達(dá)到(4.40±0.2635)%,包封率達(dá)到(48.51±14.827)%,HV-PLGAMSs溶解7天的累積釋放率達(dá)到43.36%,有相對(duì)比較長(zhǎng)的釋放周期;在體外抑菌試驗(yàn)中,HV-PLGAMSs釋放的萬(wàn)古霉素作用效果明顯。

7、r>　　2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　①大體形態(tài)觀察:其中A組1只家兔術(shù)后2周植骨部位出現(xiàn)竇道,流出膿性分泌物;術(shù)后4周,A組局部可見(jiàn)植入之顆粒骨被纖維組織覆蓋,B、C組局部可見(jiàn)骨痂形成,針刺感較硬;術(shù)后8周,A組可見(jiàn)骨痂形成填滿骨缺損區(qū),B、C組骨痂形成致密,骨缺損區(qū)完全愈合,骨折端連接良好;術(shù)后12周,各組骨缺損區(qū)完全愈合,骨折端連接良好。
　?、谘錍反應(yīng)蛋白:在術(shù)后第1周時(shí)B組顯著低于A組水平(p<0.05),C組顯著低于B

8、組水平(p<0.05),第4周時(shí)A組仍維持在較高水平,B、C組接近正常水平。
　　③血沉:在術(shù)后第2周時(shí)B組顯著低于A組水平(p<0.05),C組顯著低于B組水平(p<0.05),第4周時(shí)A組仍維持在較高水平,B、C組接近正常水平。
　　④植骨區(qū)X線觀察及評(píng)分:4周時(shí)A組可見(jiàn)有骨痂形成,仍可見(jiàn)植入之顆粒骨,骨折線清晰,B、C組可見(jiàn)有骨痂形成基本連接骨段端;8周時(shí)A組骨痂量增加,骨折線已基本消失,髓腔尚未通,B、C組新生皮質(zhì)骨

9、結(jié)構(gòu)出現(xiàn),與宿主皮質(zhì)骨連接,髓腔已基本再通;12周時(shí)三組均可見(jiàn)骨缺損區(qū)已達(dá)骨性愈合,髓腔再通。術(shù)后第2、4、8周B組X線和組織學(xué)評(píng)分均優(yōu)于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B、C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第12周A、B、C三組X線評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　?、葜补菂^(qū)組織學(xué)觀察及評(píng)分:2周時(shí)A組可見(jiàn)植入之大塊顆粒骨組織,有纖維組織填充,B、C組見(jiàn)有大量軟骨島形成,C組亦可見(jiàn)有部分微球未被吸收,附著于軟

10、骨島附近。4周時(shí)A組骨小梁稀疏,走行不規(guī)則,B、C組骨小梁較為致密,走行較為一致,C組新生骨組織周?chē)窗l(fā)現(xiàn)有微球存在。8周時(shí)A組骨小梁走行一致,原始髓腔將要形成,B、C組骨小梁形成的編織骨已逐漸向板層骨過(guò)渡,骨板周?chē)?jiàn)大量成骨細(xì)胞,髓腔基本貫通。12周:三組骨缺損區(qū)編織骨被板層骨替代,骨質(zhì)較厚為片狀,骨陷窩大量分布其中,髓腔再通。術(shù)后2、4、8、12周組織學(xué)評(píng)分A、B組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B、C組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、利用W/O/W方法制作的萬(wàn)古霉素緩釋微球,對(duì)萬(wàn)古霉素藥物本身無(wú)影響。
　　2、萬(wàn)古霉素PLGA緩釋微球在作用于金黃色葡萄球菌時(shí),其抑菌效果與單純?nèi)f古霉素相同,且抑菌時(shí)間長(zhǎng)。
　　3、手術(shù)徹底清創(chuàng)后,自體微小顆粒骨復(fù)合萬(wàn)古霉素緩釋微球植入法,對(duì)于治療感染性骨缺損是可行的。
　　4、對(duì)于治療感染性骨缺損時(shí),萬(wàn)古霉素緩釋微球?qū)Τ晒亲饔脽o(wú)影響。
　　5、對(duì)于感染性骨缺