穿心蓮內(nèi)酯抑制動脈粥樣硬化及其分子機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atcheroscIerosis,AS)的病理改變是以動脈內(nèi)膜下酯質(zhì)沉積,伴隨平滑肌細(xì)胞增殖,纖維基質(zhì)成分增加以及炎癥反應(yīng)為特征,并通過各種生長因子和活性代謝產(chǎn)物的影響和調(diào)節(jié),刺激泡沫細(xì)胞形成,泡沫細(xì)胞的不斷產(chǎn)生和堆積導(dǎo)致酯質(zhì)條紋,并進(jìn)一步變成纖維帽,逐步形成粥樣硬化性斑塊。 核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-κB)最先是從B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的kB序列特異性結(jié)

2、合的核蛋白因子,現(xiàn)已知kB序列存在于多種基因的啟動子和增強子中,NF-κB可與相關(guān)基因啟動子或增強子特殊kB序列相結(jié)合,調(diào)控多種基因的表達(dá),在體內(nèi)具有非常重要的生物學(xué)功能。 穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide,Andro)是二萜類化合物,但是目前國內(nèi)外對于Andro抗炎作用的分子機制仍然知之甚少。本實驗室先前的研究工作表明,Andro能夠共價修飾處于還原狀態(tài)的p50亞基上第62位半胱氨酸,因為該氨基酸位于NF-κB結(jié)合特

3、定DNA的關(guān)鍵部位,因此Andro的共價結(jié)合阻斷了NF-κB二聚體與靶基因特定DNA序列的結(jié)合,抑制炎癥介質(zhì)的活化。那么,在動脈粥樣硬化形成過程中,穿心蓮內(nèi)酯是否也通過抑制NF-κB信號通路的活化,具有抑制動脈粥樣硬化性狀的重要作用? 本研究旨在探索：(1)穿心蓮內(nèi)酯對NF-κB信號通路的調(diào)控作用；(2)穿心蓮內(nèi)酯對NF-κB信號通路的調(diào)控在動脈粥樣硬化中的作用：(3)初步篩選靶向抑制NF-κB的小分子化合物本研究分為體外實驗和

4、體內(nèi)實驗兩部分： 一.體外實驗。探尋穿心蓮內(nèi)酯對NF-κB信號通路的調(diào)控作用,主要包括： (一)采用E-selectin promoter-luciferase熒光素酶報告基因?qū)嶒炋矫鰽ndro是否能夠抑制TNF-α引起的NF-κB活性。 (二)用Andro預(yù)處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,再用酯多糖、佛波酯、TNF-α分別刺激細(xì)胞,然后通過流式細(xì)胞儀檢測Andro藥物干預(yù)是否可以下調(diào)活化的內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin

5、的表達(dá)。 (三)用Andro預(yù)處理小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,再用酯多糖、佛波酯、腫瘤壞死因子分別刺激上述細(xì)胞,然后應(yīng)用組織因子(TF)活性測定技術(shù)、蛋白免疫印記技術(shù)檢測Andro是否可以起到下調(diào)活化的內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞組織因子表達(dá)的作用。 (四)應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和TF promoter-luciferase熒光素酶報告基因?qū)嶒炓蕴矫鰽ndro調(diào)控組織因子的表達(dá)是通過調(diào)控哪個靶位點實現(xiàn)的? 二.體內(nèi)實驗。探索穿心蓮內(nèi)酯對NF-κ

6、B信號通路的調(diào)控在動脈粥樣硬化中的作用,主要分解為下列實驗： (一)用apoE基因缺陷型(apoE-/-)小鼠以高酯飼料誘導(dǎo)構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型。 (二)利用油紅O染色技術(shù)、H&E染色顯示主動脈竇和主動脈血管內(nèi)膜酯肪斑塊的面積,血管壁的厚度,評價Andro治療在動脈粥樣硬化斑塊酯質(zhì)沉積中的作用。 (三)全程監(jiān)測小鼠體重,評價Andro治療在物質(zhì)代謝中的作用。 (四)分別于藥物治療前后,禁食12小時后取

7、血檢測血漿TG,TC,HDL-C,LDL-C水平,評價Andro治療對酯肪代謝的影響。 (五)應(yīng)用電泳遷移率變動實驗(EMSA)分析Andro治療對NF-κB活性的影響。 (六)應(yīng)用定量PCR技術(shù)分析Andro治療對NF-κB下游與炎癥,增殖及血栓相關(guān)靶基因E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。 (七)利用免疫組化和免疫灰度統(tǒng)計技術(shù),觀察穿心蓮內(nèi)酯治療對E-selectin,VCAM-1,

8、TF,fibrin表達(dá)的影響。 本研究的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明Andro具有下列作用和功能：(1)抑制NF-κB與E-selectin啟動子的結(jié)合,并且這種抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性；(2)抑制活化內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin的表達(dá)；(3)抑制活化內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組織因子(TF)的表達(dá)；(4)特異性地抑制組織因子啟動子NF-κB位點；(5)減輕動脈粥樣硬化斑塊的酯質(zhì)損傷；(6)不影響動脈粥樣硬化小鼠的體重和血酯水平；(7)抑

9、制動脈粥樣硬化血管組織NF-κB的活性；(8)下調(diào)動脈粥樣硬化血管組織:E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA水平；(9)下調(diào)E-selectin,VCAM-1,TF,fibrin的蛋白表達(dá)。 從以上實驗結(jié)果可以得出如下結(jié)論：本研究首次明確地證明了穿心蓮內(nèi)酯通過阻斷NF-κB信號通路,抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)程；并證實了NF-κB信號通路在貫穿動脈粥樣硬化始終的炎癥中以及在斑塊的穩(wěn)定性和血栓形成方面具重要作用；進(jìn)而證實了