CREG抑制動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞表型轉化及其分子機制的研究.pdf

1、背景:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是動脈壁上聚集了脂質、細胞外基質和炎癥細胞的一種慢性炎癥性疾病。研究表明,很多種細胞,包括巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)參與AS的形成。了解AS發(fā)生發(fā)展的分子及細胞學機制,將有助于預防和治療AS所導致的臨床心腦血管事件的發(fā)生。
　　 人的E1A激活基因阻遏子(CREG)是含有220個氨基酸的

2、糖蛋白,在缺少維甲酸等誘導劑的條件下,CREG能通過拮抗E1A誘導的轉錄激活和細胞轉化,抑制人的胚胎瘤細胞增殖和VSMC的表型轉化,并促進其成熟分化。PCI術后再狹窄和AS疾病均有VSMC的遷移和增殖等病理性細胞行為參與其中。而以往本室研究已證明,CREG作為一種保護因子通過拮抗VSMC的遷移和增殖等表型轉化的生物學行為,抑制了PCI術后再狹窄。然而,CREG對AS中VSMC表型轉化的調控作用研究尚未見報道。
　　 目的:探討C

3、REG在AS發(fā)生、發(fā)展中對VSMC表型轉化的調控作用和分子機制。
　　 方法:
　　 1.標本
　　 (1)人的AS血管來源于截肢手術的糖尿病病人,正常血管來源于器官捐贈者。(2)新西蘭大白兔給予正常喂養(yǎng)和高脂喂養(yǎng)1月或者2月。高脂飼料:1％膽固醇,10%脂肪,10%蛋黃粉。白兔麻醉后取主動脈根部血管。(3)apoE(-/-)小鼠購自北京大學動物實驗中心,8周齡斷奶后給予高脂喂養(yǎng)(添加21%脂肪和0.25%膽固醇

4、)。
　　 2.免疫組化和免疫熒光染色
　　 (1)石蠟切片的免疫組化:組織分離后,PBS清洗,浸入4%福爾馬林溶液,4℃過夜。固定的組織按酒精梯度脫水,石蠟包埋。切成5μm厚的切片,烤箱烘干后脫蠟,按梯度酒精復水。切片用3%甲醛過氧化氫孵育30min,去除內源性過氧化物酶。然后在室溫下用4%小牛血清(BSA)孵育60min,阻斷非特異性抗體。加入1∶100的一抗(抗CREG,SMαactin,SM MHC和CD31抗體

5、),4℃過夜;PBS清洗后加入1∶150稀釋的二抗90min,PBS清洗后用0.05%DAB染色2min,蘇木素復染,脫水、透明后封片。光學顯微鏡照相。(2)冰凍切片的免疫熒光:組織分離后于4%多聚甲醛浸泡30min,7.5%蔗糖PBS脫水過夜。將組織包埋于OCT中冷凍,而后切成5gm的冰凍切片,3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶;4%BSA封閉后加入一抗及帶有熒光標記的二抗,在熒光顯微鏡下觀察,拍照。
　　 3.VSMC培養(yǎng)

6、r>　　 VSMC來源于心臟移植手術中人的非AS動脈,經胰酶消化后的VSMC在10%胎牛血清(FCS)DMEM中培養(yǎng)傳3-5代。VSMC經傳代后種植于0.4%FCS的DMEM中培養(yǎng)48h,添加100gg/mL oxLDL刺激不同時間點。如果用阻斷劑時,將ERK阻斷劑提前加入細胞培養(yǎng)皿中,30min后給予100μg/mL oxLDL刺激。
　　 4.蛋白純化和western blot分析
　　 細胞和組織勻漿在裂解液中裂

7、解后,15000g離心10min收集上清,測定總蛋白濃度。蛋白經濃縮膠、分離膠電泳后,轉移至PVDF膜。加入一抗及帶有HRP的二抗,添加ECL試劑盒中的熒光劑,曝光顯影。
　　 5.AS斑塊定量分析
　　 將HE染色及油紅染色的照片經Image-pro plus6.0軟件系統(tǒng)分析,計算斑塊面積所占的百分比。
　　 6.ELISA分析上清中的TNF-α和IL-1β
　　 細胞經oxLDL刺激后,在指定時間點

8、收集上清,按ELISA試劑盒說明書操作,定量分析TNF-α和IL-1β含量。
　　 結果:
　　 1.CREG在AS血管中表達下調
　　 (1)新西蘭白兔高脂喂養(yǎng)1-2月,動脈血管行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)1月時血管內膜開始增厚,內膜細胞增生活躍。與對照組相比,VSMC標志蛋白SMα-actin和SM MHC表達下降,同時CREG表達也下調。Western blot分析顯示,與正常對照組相比較,CREG在高脂喂

9、養(yǎng)的AS血管中表達明顯下調。(2)在人的AS血管中,CREG無論在內膜還是在中膜,表達均明顯下降,同時VSMC標志物Sma-actin和SM MHC也下降。(3)在apoE(-/-)小鼠高脂喂養(yǎng)2周內,CREG在動脈血管中的表達不是降低,而是明顯升高,高脂喂養(yǎng)第4周CREG表達急劇下降,而后又逐漸上升,但不能升至正常水平。同時核轉錄因子NF-κB隨著時間的推移,表達逐漸升高。
　　 2.oxLDL刺激VSMC下調CREG,過表達

10、CREG抑制VSMC增殖
　　 (1)oxLDL刺激VSMC12～24h后,CREG蛋白表達降低,同時SMα-actin和SM MHC表達也下降,P-ERK1/2表達卻上調。在CREG低表達組(CREG-DOWN)細胞給予ERK阻斷劑PD98059(50μmol/L)后再添加oxLDL,細胞增殖受到抑制。經oxLDL刺激24h,CREG正常表達(CREG-NR)組的細胞數(shù)量明顯多于CREG高表達(CREG-UP)組,而CREG-

11、DOWN組細胞數(shù)量又明顯高于CREG-NR組。Brdu陽性細胞數(shù)在CREG-DOWN組最多,其次為CREG-NR組,CREG-UP組最少。這表明:CREG過表達明顯抑制VSMC增殖,而CREG低表達則促進了VSMC的增殖。
　　 3.CREG過表達抑制NF-κB p65核轉位,降低了TNF-α和IL-1β分泌
　　 (1)在三組細胞中,血清饑餓后添加100μg/ml oxLDL刺激12～24h,提取核蛋白后行wester

12、n blot檢測NF-κB p65。在CREG-NR組細胞中,核內NF-κB表達明顯增多,在CREG-UP組細胞中NF-κB表達僅輕度上升,而CREG-DOWN組細胞中,NF-κB表達明顯高于其他兩組,均有顯著差異(P＜0.05)。同時應用ELISA方法檢測三組上清中分泌TNF-α和IL-1β的變化。經刺激24h,三組細胞分泌的TNF-αIL-1β有明顯差異,CREG-UP組細胞上清中分泌TNF-α和IL-1β明顯少于其他兩組(P＜0.

13、05)。
　　 4.體內過表達CREG能夠減緩AS進程
　　 apoE(-/-)小鼠高脂喂養(yǎng)8周后,將帶有CREG和GFP的腺病毒(AD-GFP-CREG)4.75×1010pfu經尾靜脈注入體內,只帶有GFP的腺病毒(AD-GFP)作為對照,繼續(xù)給予6周高脂喂養(yǎng)。注射后1～5周在動脈血管壁上均可檢測到外源性CREG和GFP蛋白。在1～2周時CREG和GFP表達逐漸增高,并在2周時達到高峰,而后CREG和GFP組表達逐漸