CREG抑制動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景:動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是動(dòng)脈壁上聚集了脂質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥細(xì)胞的一種慢性炎癥性疾病。研究表明,很多種細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)參與AS的形成。了解AS發(fā)生發(fā)展的分子及細(xì)胞學(xué)機(jī)制,將有助于預(yù)防和治療AS所導(dǎo)致的臨床心腦血管事件的發(fā)生。
　　 人的E1A激活基因阻遏子(CREG)是含有220個(gè)氨基酸的

2、糖蛋白,在缺少維甲酸等誘導(dǎo)劑的條件下,CREG能通過拮抗E1A誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞轉(zhuǎn)化,抑制人的胚胎瘤細(xì)胞增殖和VSMC的表型轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)其成熟分化。PCI術(shù)后再狹窄和AS疾病均有VSMC的遷移和增殖等病理性細(xì)胞行為參與其中。而以往本室研究已證明,CREG作為一種保護(hù)因子通過拮抗VSMC的遷移和增殖等表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)行為,抑制了PCI術(shù)后再狹窄。然而,CREG對AS中VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用研究尚未見報(bào)道。
　　 目的:探討C

3、REG在AS發(fā)生、發(fā)展中對VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用和分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.標(biāo)本
　　 (1)人的AS血管來源于截肢手術(shù)的糖尿病病人,正常血管來源于器官捐贈(zèng)者。(2)新西蘭大白兔給予正常喂養(yǎng)和高脂喂養(yǎng)1月或者2月。高脂飼料:1％膽固醇,10%脂肪,10%蛋黃粉。白兔麻醉后取主動(dòng)脈根部血管。(3)apoE(-/-)小鼠購自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,8周齡斷奶后給予高脂喂養(yǎng)(添加21%脂肪和0.25%膽固醇

4、)。
　　 2.免疫組化和免疫熒光染色
　　 (1)石蠟切片的免疫組化:組織分離后,PBS清洗,浸入4%福爾馬林溶液,4℃過夜。固定的組織按酒精梯度脫水,石蠟包埋。切成5μm厚的切片,烤箱烘干后脫蠟,按梯度酒精復(fù)水。切片用3%甲醛過氧化氫孵育30min,去除內(nèi)源性過氧化物酶。然后在室溫下用4%小牛血清(BSA)孵育60min,阻斷非特異性抗體。加入1∶100的一抗(抗CREG,SMαactin,SM MHC和CD31抗體

5、),4℃過夜;PBS清洗后加入1∶150稀釋的二抗90min,PBS清洗后用0.05%DAB染色2min,蘇木素復(fù)染,脫水、透明后封片。光學(xué)顯微鏡照相。(2)冰凍切片的免疫熒光:組織分離后于4%多聚甲醛浸泡30min,7.5%蔗糖PBS脫水過夜。將組織包埋于OCT中冷凍,而后切成5gm的冰凍切片,3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶;4%BSA封閉后加入一抗及帶有熒光標(biāo)記的二抗,在熒光顯微鏡下觀察,拍照。
　　 3.VSMC培養(yǎng)

6、r>　　 VSMC來源于心臟移植手術(shù)中人的非AS動(dòng)脈,經(jīng)胰酶消化后的VSMC在10%胎牛血清(FCS)DMEM中培養(yǎng)傳3-5代。VSMC經(jīng)傳代后種植于0.4%FCS的DMEM中培養(yǎng)48h,添加100gg/mL oxLDL刺激不同時(shí)間點(diǎn)。如果用阻斷劑時(shí),將ERK阻斷劑提前加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中,30min后給予100μg/mL oxLDL刺激。
　　 4.蛋白純化和western blot分析
　　 細(xì)胞和組織勻漿在裂解液中裂

7、解后,15000g離心10min收集上清,測定總蛋白濃度。蛋白經(jīng)濃縮膠、分離膠電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入一抗及帶有HRP的二抗,添加ECL試劑盒中的熒光劑,曝光顯影。
　　 5.AS斑塊定量分析
　　 將HE染色及油紅染色的照片經(jīng)Image-pro plus6.0軟件系統(tǒng)分析,計(jì)算斑塊面積所占的百分比。
　　 6.ELISA分析上清中的TNF-α和IL-1β
　　 細(xì)胞經(jīng)oxLDL刺激后,在指定時(shí)間點(diǎn)

8、收集上清,按ELISA試劑盒說明書操作,定量分析TNF-α和IL-1β含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.CREG在AS血管中表達(dá)下調(diào)
　　 (1)新西蘭白兔高脂喂養(yǎng)1-2月,動(dòng)脈血管行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)1月時(shí)血管內(nèi)膜開始增厚,內(nèi)膜細(xì)胞增生活躍。與對照組相比,VSMC標(biāo)志蛋白SMα-actin和SM MHC表達(dá)下降,同時(shí)CREG表達(dá)也下調(diào)。Western blot分析顯示,與正常對照組相比較,CREG在高脂喂

9、養(yǎng)的AS血管中表達(dá)明顯下調(diào)。(2)在人的AS血管中,CREG無論在內(nèi)膜還是在中膜,表達(dá)均明顯下降,同時(shí)VSMC標(biāo)志物Sma-actin和SM MHC也下降。(3)在apoE(-/-)小鼠高脂喂養(yǎng)2周內(nèi),CREG在動(dòng)脈血管中的表達(dá)不是降低,而是明顯升高,高脂喂養(yǎng)第4周CREG表達(dá)急劇下降,而后又逐漸上升,但不能升至正常水平。同時(shí)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB隨著時(shí)間的推移,表達(dá)逐漸升高。
　　 2.oxLDL刺激VSMC下調(diào)CREG,過表達(dá)

10、CREG抑制VSMC增殖
　　 (1)oxLDL刺激VSMC12～24h后,CREG蛋白表達(dá)降低,同時(shí)SMα-actin和SM MHC表達(dá)也下降,P-ERK1/2表達(dá)卻上調(diào)。在CREG低表達(dá)組(CREG-DOWN)細(xì)胞給予ERK阻斷劑PD98059(50μmol/L)后再添加oxLDL,細(xì)胞增殖受到抑制。經(jīng)oxLDL刺激24h,CREG正常表達(dá)(CREG-NR)組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于CREG高表達(dá)(CREG-UP)組,而CREG-

11、DOWN組細(xì)胞數(shù)量又明顯高于CREG-NR組。Brdu陽性細(xì)胞數(shù)在CREG-DOWN組最多,其次為CREG-NR組,CREG-UP組最少。這表明:CREG過表達(dá)明顯抑制VSMC增殖,而CREG低表達(dá)則促進(jìn)了VSMC的增殖。
　　 3.CREG過表達(dá)抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位,降低了TNF-α和IL-1β分泌
　　 (1)在三組細(xì)胞中,血清饑餓后添加100μg/ml oxLDL刺激12～24h,提取核蛋白后行wester

12、n blot檢測NF-κB p65。在CREG-NR組細(xì)胞中,核內(nèi)NF-κB表達(dá)明顯增多,在CREG-UP組細(xì)胞中NF-κB表達(dá)僅輕度上升,而CREG-DOWN組細(xì)胞中,NF-κB表達(dá)明顯高于其他兩組,均有顯著差異(P＜0.05)。同時(shí)應(yīng)用ELISA方法檢測三組上清中分泌TNF-α和IL-1β的變化。經(jīng)刺激24h,三組細(xì)胞分泌的TNF-αIL-1β有明顯差異,CREG-UP組細(xì)胞上清中分泌TNF-α和IL-1β明顯少于其他兩組(P＜0.

13、05)。
　　 4.體內(nèi)過表達(dá)CREG能夠減緩AS進(jìn)程
　　 apoE(-/-)小鼠高脂喂養(yǎng)8周后,將帶有CREG和GFP的腺病毒(AD-GFP-CREG)4.75×1010pfu經(jīng)尾靜脈注入體內(nèi),只帶有GFP的腺病毒(AD-GFP)作為對照,繼續(xù)給予6周高脂喂養(yǎng)。注射后1～5周在動(dòng)脈血管壁上均可檢測到外源性CREG和GFP蛋白。在1～2周時(shí)CREG和GFP表達(dá)逐漸增高,并在2周時(shí)達(dá)到高峰,而后CREG和GFP組表達(dá)逐漸